Golden Gate连接相比其它克隆方法有一些优点: 基于核酸外切酶的方法如Gibson连接,DNA片段末端需要20-40bp的同源序列确定连接顺序,所以若目的片段本身的5'或3'末端含有同源序列则不能用此法连接,但可用Golden Gate克隆。 使用Gateway 克隆系统会产生含有一个编码8个氨基酸的attB重组痕迹的结构,但是Golden Gate连接能设计成...
Golden Gate克隆在2008年由Engler等人提出,是依赖IIS型限制酶的无缝克隆技术,能媲美Gibson Assembly,主要用于多片段克隆组装。实验步骤与传统克隆技术相似,但限制性内切酶酶切原理不同。传统酶切使用的TypeII型限制性内切酶通常识别4-8 bp的回文序列,并在识别序列内部切割产生粘性末端或平末端。 Golden Gate克隆技术通过T...
导读:无缝克隆技术是时下最流行的质粒构建技术,几乎每个分子生物学实验室都在使用。之前我给大家详细讲解了Gibson Assembly的实验设计和操作流程,那么这次给大家介绍另外一种无缝克隆方法——Golden Gate Assembly,希望能对大家的质粒构建实验有所帮助。说到分子克隆,几乎每个做过质粒构建的小伙伴都知道Gibson Assembly,这...
Golden Gate连接相比其它克隆方法有一些优点: 基于核酸外切酶的方法如Gibson连接,DNA片段末端需要20-40bp的同源序列确定连接顺序,所以若目的片段本身的5'或3'末端含有同源序列则不能用此法连接,但可用Golden Gate克隆。 使用Gateway 克隆系统会产生含有一个编码8个氨基酸的attB重组痕迹的结构,但是Golden Gate连接能设计成...
Golden Gate Assembly Protocol for using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2) (NEB #E1602) 3.现在RNAi所用的shRNA则需要用Gibson Assembly Gibson Assembly® Gibson Assembly Cloning - addgene Gibson Assembly® Master Mix – Assembly (E2611) ...
前者的发现使得质粒改造变得成为可能,而后者的发明使得质粒构建变得如此快捷。我们在前文中提到限制性克隆的主要缺点是依赖特异性的酶切位点,然而限制性克隆中的Golden Gate克隆 (以下简称GG克隆)则并不逊色于Gibson assembly,堪称质粒改造王者,根本原因是GG克隆中所用到的IIS酶十分特殊。
我们期望Golden Gate cloning system将成为植物细胞器DNA编辑的宝贵资源。 研究方法 植物原生质体表达质粒的构建 DdCBE Golden Gate 使用Gibson组装构建目的载体,编码TAL N末端结构域的序列 HA tag, FLAG tag,TAL C端域分离被优化的DddAtox和 UGI 密码子用于在双子叶植物(拟南芥)中表达,并通过集成DNA技术合成。
前者的发现使得质粒改造变得成为可能,而后者的发明使得质粒构建变得如此快捷。我们在前文中提到限制性克隆的主要缺点是依赖特异性的酶切位点,然而限制性克隆中的Golden Gate克隆 (以下简称GG克隆)则并不逊色于Gibson assembly,堪称质粒改造王者,根本原因是GG克隆中所用到的IIS酶十分特殊。
其中最具代表的是In-Fusion技术(Willer et al., 2000; Zhu et al., 2007)和Gibson Assembly技术(Gibson et al., 2010; Gibson et al., 2009)。但是，现有的两类方法均有其明显的不足之处。首先，GoldenGate技术因克隆片段中可能含有相应的Type IIS酶切位点而不适合于长片段克隆。迄今为止，只发现两个识别...
Seamless methods such as Gibson assembly3, USER cloning4, and In-fusion5 have been used successfully to stitch together pieces of DNA. However, these methods require amplification of fragments with custom overlapping sequences and are not modular by nature. In contrast, Golden Gate6 is a ...