单染管:分别需要只加PI和荧光标记的Annexin V两个单染管,用来调节2个荧光通道的补偿值; 荧光素之间的补偿值应保持恒定;双荧光染色时,如果一个荧光很强,而另一个很弱,则一定要做补偿;补偿只应用在同一个激光激发的不同荧光素之间,避免补偿不足和过度补偿。【3】 02 细胞浓度过高 细胞浓度过高,培养基消耗过快...
1,必须活细胞检测,不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。2,特殊细胞的染色方法:在消化或吹打时,有些细胞(如神经元细胞)很容易受到损伤,导致晚期凋亡或坏死比例非常高,不能反映真实结果。实验的解决方法:先低速离心,吸取细胞培养板中的液体,留少许液体,加入适量PI和Annexin-V染色10min后,...
流式fitc和pi四象限实验是基于细胞状况的荧光信号来进行分析,首先通过FITC和PI染色将细胞分类,然后在流式细胞仪中进行检测得到荧光信号。 2、步骤 (1)取相应数量的细胞,进行细胞处理,并用PBS冲洗一次去除培养基和残留药物等。 (2)将细胞溶解液均匀加入每个实验管中,加入FITC染液和PI染液,使细胞达到充分染色。 (3...
7.200g离心5 min,弃上清,加入190 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞。 8.加入10 μl碘化丙啶染色液,轻轻混匀,冰浴避光放置。 9.进行流式细胞仪检测,Annexin V-FITC为绿色荧光,PI为红色荧光。 注意:FITC为绿色荧光,此检测方法不适用于已带绿色荧光标签的细胞 结果示例及分析 四个象限的意义 左上/P2-Q1:...
晚期凋亡细胞: Annexin ⅴ-FITC (+);PI (+); 机械性坏死:Annexin ⅴ-FITC (-);PI (+); 5 对照组凋亡比例高的原因: 细胞状态不好; 细胞收集后存放的时间太长,没有及时染色; 细胞表面原有的PS相对较多,应选用低浓度的AnnexinV标记; PBMC表面往往有血小板黏附在细胞表面,造成Annexin V阳性率偏高; ...
Annexin V-FITC/PI 是将膜联蛋白V(Annexin V)与荧光素异硫氰酸酯(FITC)结合,同时结合碘化丙啶(PI)的一种双重染色方案,用于检测细胞凋亡。此组合通过检测细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸(PS)和细胞膜完整性来区分活细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。
检测原理 Annexin V-FITC:在细胞凋亡的早期,PS从细胞膜内侧翻转到外侧。Annexin V是 一种与PS高亲和力结合的蛋白质,能够标记外翻的PS,从而检测早期凋亡细胞。 PI染色:PI是一种能够进入膜完整性已受损的细胞的染料。由于活细胞和早期凋亡 细胞的膜完整性较好,PI无法进
所以,通过Annexin V和PI双染的方法,就可以把早期凋亡的细胞与晚期凋亡加坏死的细胞区分开来。 Annexin V-FITC/PI法的实验步骤: 1,细胞按照实验方案进行凋亡诱导,300g离心5min,弃上清,收集细胞,PBS洗涤细胞一次,轻轻重悬细胞并计数。 2,取1-5×10^5重悬的细胞,300g离心5min,弃上清。用PBS洗涤细胞一次,离心后...
4. 加5μL FITC-Annexin V和5μL PI(50μg/mL)。其中对照细胞分为:不染色组、单染Annexin V组、单染PI组、双染Annexin V+PI组。5. 轻柔弹起混匀,室温(25℃)避光孵育15min。6. 加400μL 1×Binding Buffer至每管中,混匀。7. 1hr内上流式细胞仪检测。所需试剂、耗材及仪器:15mL离心管,1...
碘化丙啶(PI)是一种不能穿过细胞膜的染料,可以将活细胞和早期凋亡细胞染成红色荧光,但会对晚期凋亡细胞和坏死细胞进行染色。染色后,活细胞显示少量或无荧光(Annexin V-/PI-),早期凋亡细胞显示绿色荧光(Annexin V+/PI-),晚期凋亡细胞和坏死细胞显示红色和绿色荧光(Annexin V+/PI+)。