Cas9 蛋白与人工设计的sgRNA结合成为 sgRNA-Cas9 蛋白复合体并在其引导之下结合到特定的核苷酸序列切割目标...
CRISPRi和CRISPRa均可通过针对不同的基因设计不同的sgRNA进行批量调控或实现同时激活/抑制某些功能相关的基因，是了解复杂基因网络功能的利器。汉恒专营工具病毒十余载，可提供CRISPRi/CRISPRa的相关质粒以及病毒工具，如有技术问题或产品订购需求，欢迎随时咨询！参考文献：[1] Dominguez AA, Lim WA, Qi LS. Beyond...
为Cas9提供靶向特异性和支架及结合能力。这种合成融合体在自然界中并不存在，通常也被称为sgRNA。
提高转录抑制或激活的sgRNA优化细节:对于CRISPRi,靶向特定基因TSS的-50至+300bp区间可实现强抑制,在TSS下游+50bp至+100bp处可实现最大抑制效果;sgRNA中避免出现连续相同碱基序列(例如TTTT或CCCC)。对于使用多激活因子串联的CRISPRa,当靶向TSS上游-50bp至-400bp的区间时,发现了最佳的基因激活;对于使用SAM系统的激活,...
更多适用的基因种类,由于dCas9-KRAB CRISPRi系统是在DNA水平抑制基因表达,因此适用于多种转录本,包括mRNA、非编码RNA、microRNA、反义转录本、核定位RNA以及聚合酶III 转录本的转录抑制;特异性,dCas9-KRAB CRISPRi系统可实现高效抑制同时,几乎没有脱靶现象;可以针对不同基因设计多个sgRNA,实现对多个基因的同时抑制。
Cas9 sgRNA的设计原则包括以下几个方面: 1.评分:优先挑选高评分靶点。 2.碱基序列:Spcas9为20bp+NGG;Sacas9为21bp+NNGRRT。同时,应避免出现连续4个及以上的T,这是终止信号。 3.GC含量:GC含量应在40%~60%之间。 4.靶点位置:必须设计在CDS区,设计在独立外显子,尽量靠近蛋白N端(编码区前三分之一)。不应...
设计sgRNA时，可参照sgRNA工具网站（crispr.mit.edu）设计多条sgRNA以降低脱靶率。构建sgRNA质粒的方法包括：使用BbsI酶在37℃条件下对载体质粒pAC1371进行酶切；通过琼脂糖凝胶电泳切胶，使用DNA片段回收试剂盒回收目的载体片段；进行引物退火，使用特定参数在PCR环仪中进行；使用连接酶进行连接；进行质粒转化...
本文将探讨CRISPR/Cas9系统中sgRNA的设计原则及脱靶效应的评估方法。 二、sgRNA的设计原则 1.靶点选择:选择合适的基因靶点是sgRNA设计的第一步。通常,应选择基因组中特异性较高的序列作为靶点,以减少脱靶的可能性。 2.序列优化:sgRNA的序列应与靶点序列高度互补,以保证高效的切割效率。同时,应避免出现二级结构,以...
CRISPR/Cas9系统,是由识别模板的sgRNA以及切割蛋白的Cas9组成,来造成DNA切口,随后通过自身非同源末端链接(NHEJ)和同源重组(HR)实现基因编辑。 sgRNA决定了CRISPR/Cas9基因编辑实验的成败,而传统的sgRNA设计网站虽然有很多,但设计过程繁琐,且得到的sgRNA还...
Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA链条，并把其称为sgRNA(single-...