2. gRNA序列筛选 根据脱靶效应得分和靶向活性参数，选择至少2个，理论上编辑效率较高 gRNA序列，通常约2...
1）用 BbsI 在 37℃条件下酶切载体质粒 pAC1371。2）琼脂糖凝胶电泳，切胶用 DNA 片段回收试剂盒回...
CRISPR-Cas9系统的设计和优化 CRISPR-Cas9系统由Cas9核酸酶和一个导向RNA（gRNA）组成，是基因组编辑技术...
首先激活特定基因的表达可以通过dCas9与转录调节因子VP64、EDLL等的融合来实现(图2)。将dCas9与典型的转录激活因子VP64融合后,当dCas9-VP64通过gRNA靶向到靶基因的启动子序列时,该复合物通常能够招募调节哺乳动物细胞转录的转录因子(Paul and Qi, 2016)。此外,dCas9-VP64系统还可用于植物中内源基因的转录激活(M...
其中CRISPR II类系统是目前使用最为广泛的RNA指导核酸内切酶技术,该系统有两个主要的组分:引导RNA(guide RNA,gRNA)和核酸内切酶(Cas9)。Cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH,它们分别负责切割DNA链的两条链,将这两个保守的核酸内切酶结构域进行突变,其中RuvC催化结构域的第10位天冬氨酸突变为丙氨酸(D...
一个完整的dCas9-KRAB CRISPRi慢病毒载体系统包含两个部分,gRNA表达载体和dCas9-KRAB(或者dCas9-KRAB-MeCP2)表达载体。设计基因抑制实验时,只需要设计打靶目的基因的gRNA表达载体即可。 图7. dCas9-KRAB CRISPRi慢病毒载体系统 优势 不改变内源基因组背景:与CRISPR基因编辑、传统基因敲除技术不同,dCas9-KRAB CRIS...
dCas9虽然失去了切割DNA的能力,但仍然可以在gRNA的引导下与特定的DNA序列结合。因此,保留Cas9指向gRNA结合DNA序列的能力,同时与转录激活因子、抑制因子、表观修饰酶等效应分子融合表达,将效应因子导向至目标启动子或其他修饰区域,可达到强行激活/抑制特定基因的目的。
dCas9蛋白是Cas9蛋白的突变体,即Cas9内切酶的RuvC1和HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变。因此,dCas9蛋白的内切酶活性全部消失,只保留由gRNA引导进入基因组的能力。 CRISPR-dCas9系统提供了一个研究定点转录调控的平台。在这个平台中,dCas9主要是与其他效应蛋白融合(如GFP、转录因子、组蛋白修饰等),进行基因调控,基因...
即因Cas9的RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变产生，其剪切酶活性丧失，只保留了由gRNA引导进入...
图4 不同dCas9 / gRNA系统标记端粒 03 dCas9的优势 高特异性:dCas9可以精确地识别并结合目标DNA序列,减少了非特异性结合的风险。 多功能性:dCas9的多功能性使其在多种生物学研究和应用中具有广泛的应用潜力。 安全性:由于dCas9不具备切割DNA的能力,因此在某些应用中可能比传统的Cas9系统更安全。 04 结语 dCa...