2. gRNA序列筛选 根据脱靶效应得分和靶向活性参数，选择至少2个，理论上编辑效率较高 gRNA序列，通常约2...
1）用 BbsI 在 37℃条件下酶切载体质粒 pAC1371。2）琼脂糖凝胶电泳，切胶用 DNA 片段回收试剂盒回...
dCas9虽然失去了切割DNA的能力,但仍然可以在gRNA的引导下与特定的DNA序列结合。 CRISPR/dCas9系统的作用机制 (1)人工设计合成的一小段特异性RNA序列(single guide RNA,sgRNA)与dCas9和转录调控因子形成的融合蛋白组成复合体; (2)该复合体中的sgRNA的碱基互补配对序列与目标基因结合; (3)dCas9-sgRNA复合物作为一...
dCas9虽然没有剪切DNA的能力,但仍然可以在gRNA的引导下与特定的DNA序列结合。由此,可以利用dCas9能与DNA序列结合的能力将dCas9转化为能激活基因表达的转录因子。研究发现,dCas9只有通过与其他蛋白融合后,才能够发挥转录因子的作用,促进或抑制基因的表达,并且不失去与gRNA 结合的能力。 例如:当转录激活子VP64与dCas9...
dCas9虽然失去了切割DNA的能力,但仍然可以在gRNA的引导下与特定的DNA序列结合。 CRISPR/dCas9系统的作用机制 (1)人工设计合成的一小段特异性RNA序列(single guide RNA,sgRNA)与dCas9和转录调控因子形成的融合蛋白组成复合体; (2)该复合体中的sgRNA的碱基互补配对序列与目标基因结合;...
CRISPR-Cas9全程实操教程:从gRNA设计到挑单克隆全程指导 手把手教你利用CRISPR-Cas9系统精准敲除靶标基因 一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析 一文掌握CRISPR/Cas9系统操作方法,超详细protocol来袭! >>> 以小鼠GATA4为例: 打开UCSC的网站: 点击RefSeq Gene中的第一个,绿框所示 此处...
一个完整的dCas9-KRAB CRISPRi慢病毒载体系统包含两个部分,gRNA表达载体和dCas9-KRAB(或者dCas9-KRAB-MeCP2)表达载体。设计基因抑制实验时,只需要设计打靶目的基因的gRNA表达载体即可。 图7. dCas9-KRAB CRISPRi慢病毒载体系统 优势 不改变内源基因组背景:与CRISPR基因编辑、传统基因敲除技术不同,dCas9-KRAB CRIS...
dCas9虽然没有剪切DNA的能力,但仍然可以在gRNA的引导下与特定的DNA序列结合。由此,可以利用dCas9能与DNA序列结合的能力将dCas9转化为能激活基因表达的转录因子。研究发现,dCas9只有通过与其他蛋白融合后,才能够发挥转录因子的作用,促进或抑制基因的表达,并且不失去与gRNA 结合的能力。
Kearns等人在稳定表达dCas9-LSD1的小鼠胚胎干细胞系中,设计Oct4基因的远端增强子区域的gRNA,Oct4基因被抑制。然而,当dCas9-LSD1针对Oct4启动子时,没有观察到效果。这使得dCas9-LSD1成为研究增强子调控活性的工具。这与其他系统如dCas9-KRAB(它们是更全面的基因表达控制器)互补。当靶向上游增强子时,dCas9-LSD1也...
CRISPR/Cas9系统已不仅仅是一种革命性的基因编辑工具,还能在各种原核和真核生物中调控基因转录。Cas9的核酸酶发生双突变产生“钝化”和“死亡”Cas9,即“dead Cas9”,这种核酸酶失去切割DNA的功能,但在gRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。 近年来,由CRISPR/Cas9衍生而来的CRISPR-dCas9系统已被用于基因...