从先前的RNAi筛选结果使用CRISPRmod CRISPRi试剂进行正交验证。在hEF1α启动子下组成表达dCas9-SALL1-SDS3的U2OS细胞,使用DharmaFECT 4转染试剂,用50nM的混合sgRNAs或ON-TARGETplus SMARTpools (50nM)靶向RPA2、RPA1或RRM2,转染72小时后,将细胞固定,用抗磷酸化- h2ax抗体染色,并用Hoechst染色法鉴定细胞核。用...
从先前的RNAi筛选结果使用CRISPRmod CRISPRi试剂进行正交验证。在hEF1α启动子下组成表达dCas9-SALL1-SDS3的U2OS细胞,使用DharmaFECT 4转染试剂,用50nM的混合sgRNAs或ON-TARGETplus SMARTpools (50nM)靶向RPA2、RPA1或RRM2,转染72小时后,将细胞固定,用抗...
RNAi 的特点: CRISPRi 的特点: Genotype-Phenotype的关联是研究基因功能和相关疾病治疗的基础问题。Loss-of-function (LOF) 实验,通过干扰正常的基因表达后观察相应的表型是解析基因功能的金标准。始于2000年的RNAi和近年来众多实验室普及的CRISPR/Cas9是实现基因沉默的两种主要工具,这里简单介绍。 RNAi 与 CRISPR/Cas9...
目前，基因干扰方面应用最广泛最成熟的还是短发卡RNA（shRNA）介导的RNAi技术。过去十几年，RNAi一直是基因功能研究尤其是功能基因组学筛选的首选方法。但是CRISPR技术的横空出世，凭借着更低的脱靶效率，更高的干扰水平，尤其是乘着今年诺贝尔化学奖的东风，势必会冲击RNAi的王座，成为审稿人和专家眼中的新宠儿。那么，...
当初为了过表达一个基因,从 PCR 开始做起,先构了质粒,后转染了细胞,眼看着进行到了药物筛选的过程,小细胞们没能挺住,以失败告终。 后来又需要下调一个基因的表达量,我采用了 RNAi 来干扰基因表达,检测后发现居然没有敲降效果。 遇到问题,第一时间想到的就是我的师兄师姐门,根据他们的经验(血泪史)来给大家整理...
shRNA vs gRNA: RNAi技术在生物科研领域曾经风靡一时,特别是应用在标靶基因的筛选,未知功能的研究,抗病毒和肿瘤治疗等。然而,随着RNAi脱靶效应引起对蛋白激酶STK33的误判导致大量药研学者入坑的事实被揭露,RN…
RNAi一般是向细胞中引入siRNA或ShRNA(经Dicer酶剪切后可形成siRNA),进而降解相应的mRNA,通过功能缺失表型来进行基因筛选。 RNAi原理视频: 由此可知,RNAi主要标靶成熟的RNA,是一种基因下调(knockdown)方法,但该技术并不能完全去除基因的功能。 而真正能实现基因完全功能丧失的是锌指酶ZFN和TALEN,它们通过DNA结合结构域(...
最近的一项利用CRISPR开展的研究驳斥了多年来利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)针对一种得到很好研究的癌症药物靶标的研究结果[1]。但是对作为一种筛选工具的RNAi而言,这是将它钉在棺材里的最后一颗钉子吗? 大量的RNAi研究已证实编码一种蛋白激酶的基因MELK对癌细胞是必需的。当美国冷泉港实验室的研究人员着手证实...
当然,如果想要暂时抑制基因功能而不改变遗传密码,或者想要下调基因功能而非完全抑制时,应用RNAi技术还是可取的。但这种种迹象已经在显示着RNAi的王者陨落已悄然临近... CRISPR在基因筛选及功能研究方面有着绝对的优势 Michael Bassik教授和Rene Bernards教授分别通过shRNA文库和CRISPR gRNA文库进行平行实验,证明使用gRNA文库...
RNAi作为转录后基因沉默技术，通过双链RNA诱导细胞内microRNA机制，破坏互补mRNA，实现基因敲减。CRISPR/Cas9则依赖Cas9核酸酶，通过sgRNA引导对DNA切割，引发DNA修复过程中的插入突变，从而产生功能丧失的等位基因敲除。两种技术在基因沉默的生物学机制上存在根本区别，导致表型效应各异。例如，K562细胞系中，...