不同的细胞最佳 MOI 不一样,而且也取决于细胞对 Cas9 蛋白的耐受。 ⑩ 选择最合适的 Cas9 稳转株后,扩培并冻存细胞供后续使用。 ⑪ 接下来就可以根据文库的大小,扩培需要的 Cas9 细胞量。 *注意:Cas9 稳转株构建好后,建议使用之前验证过的 sgRNA 进行编辑效率测试,编辑效率直接决定后续筛选的效果。 5. sgRN...
LentiPool CRISPR 文库无需高通量基础设施即可进行 CRISPR-Cas9 筛选。这些高质量的混合慢病毒文库涵盖与我们的 LentiArray 文库相同的基因靶点,以即用型高滴度(>1 × 108TU/mL)慢病毒颗粒的形式提供,用于影响更高的基因敲除筛选。 LentiPool CRISPR 文库包括为每个靶向基因编码多达四个 gRNA ...
2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞：将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现每个细胞只有一个基因被编辑。3. 阳性或阴性筛选：根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指施加一定的筛选压力（如药物），经文库扰动...
CRISPR/Cas9文库筛选是用计算机设计靶向多个基因的sgRNA,组成sgRNA文库,将sgRNA文库进行慢病毒包装,随后转至宿主细胞以引入各种基因突变,然后在细胞培养过程中通过施加一些筛选条件,导致部分细胞死亡,最终通过高通量测序等方法获取存活细胞中富集的sgRNA,分析其对应的基因,从而鉴定出影响表型的候选基因。 图1 CRISPR/Cas9基因...
解决办法②：过度培养会使pool产生偏差。在细胞达到最佳筛选数量时就应该实行筛选操作了。五、CRISPR文库筛选FAQ 1. 对于MOI本身很高的细胞，应该怎么转染？如果目标细胞本身的MOI很高，可以尝试使用更低的病毒载量进行转染，以避免过度表达Cas9对细胞的不利影响。在这种情况下，需要进行MOI的优化，以确定最佳的病毒载量...
CRISPR/Cas9高通量筛选技术是一种强大的工具,特别适用于肿瘤细胞的阳性或阴性筛选。通过这种技术,我们可以对靶向候选基因(编码和非编码基因)的导向RNA(GRNA)进行富集,从而找到我们感兴趣的目的基因。整个流程包括以下几个步骤: 慢病毒文库构建 📚 首先,我们需要构建一个慢病毒文库。这个文库将包含所有可能的GRNA,它们...
CRISPR/Cas9文库筛选基本流程 1. sgRNA文库的设计与合成:确定待研究的基因列表,选择合适的sgRNA设计软件(如CRISPR-FOCUS、CHOPCHOP、CRISPR library designer(CLD)、Cas-designer等)。为确保基因能够被编辑,每个基因一般设计4-6个sgRNA。 2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞:将sgRNA文库进行慢病毒包装,并以较低的病毒...
在二维细胞培养模型中，功能基因组筛选可能限制了对肿瘤微环境治疗靶点的识别。加拿大多伦多大学、牛津大学以及中国上海市肺科医院和四川大学的研究人员通过CRISPR-Cas9筛选对比2D细胞培养与异种移植模型，发现MEN1是一个具有肿瘤微环境依赖性的关键基因。MEN1的敲除对外增殖无影响，但对小鼠肿瘤生长有显著影响，特别是在...
案例1——慢病毒&CRISPR/Cas9文库(全基因组文库) Elaiophylin triggers paraptosis and preferentially kills ovarian cancer drug-resistant cells by inducing MAPK hyperactivation 作者单位:华中科技大学同济医学院 IF:38.104 精细调节的丝裂...