2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞：将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现每个细胞只有一个基因被编辑。3. 阳性或阴性筛选：根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指施加一定的筛选压力（如药物），经文库扰动...
整个流程包括以下几个步骤: 慢病毒文库构建 📚 首先,我们需要构建一个慢病毒文库。这个文库将包含所有可能的GRNA,它们能够靶向我们感兴趣的基因。 文库病毒感染细胞 🦠 接下来,将这个文库病毒感染到细胞中。病毒感染后,细胞会表达出相应的GRNA,从而对基因进行剪切。 细胞实验筛选 🔍 在细胞实验中,我们可以通过观...
CRISPR-Cas9实验流程如下: 1.设计sgRNA:根据目标基因的序列,设计合适的sgRNA。sgRNA是一段引导Cas9蛋白到特定DNA序列的RNA分子。 2.合成sgRNA:可以通过化学合成或体外转录的方法合成sgRNA。 3.构建CRISPR-Cas9表达载体:将sgRNA和Cas9蛋白的编码序列构建到合适的表达载体中。 4.转染细胞:将构建好的CRISPR-Cas9表达载体转...
通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行基因操作,在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进行切割,如下图所示。 因此本实验的关键步骤是设计一对20bp(不包括NGG在内的)完全互补的oligo...
Cas9和sgRNA分别通过两个不同病毒表达。实验的一般流程是,先用Cas9病毒感染目的细胞,通过抗性筛选(puro)筛选出稳定细胞株,再用sgRNA病毒去感染Cas9稳定株,最后通过流式(GFP)或者抗性(neo)筛选出sgRNA阳性表达细胞。 讲座免费⬇️,欢迎扫码来参加! 2. SAM基因过表达 ...
1、Human CRISPR Knockout Pooled Library (Brunello)一、 lentiCas9-Blast质粒的基本信息:由于cas9自待的抗性基因是我们不需要,在抗性基因两边突变出酶切位点,酶切掉原本的抗性基因。换成另一种。1. lentiCas9-Blast质粒购买来时是以细菌的形式存在的,先需要扩大培养。2. 试剂盒提取质粒,并测定浓度。二、 慢...
CRISPR/Cas9高通量文库筛选方法中,最关键的步骤是构建慢病毒载体。将sgRNA文库进行慢病毒包装,并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系,确保每个细胞只进入1个病毒,从而实现针对不同sgRNA相对应基因的功能筛选。 阳性或阴性筛选筛选 工作的另一项重要步骤是选择恰当的筛选策略。根据研究目的不同,CRISPR高通量筛选分为...
一、利用Cas9 质粒建立knock-out 细胞系实验的详细过程 1.1 确定待敲除基因的靶位点 1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo(引物) 1.3 构建表达sgRNA的质粒 1.4 sgRNA活性检测 1.5 利用Cas9 质粒建立knock-out 细胞系 1.1、确定待敲除基因的靶位点
七、CRISPR-Cas9基因技术研究流程 以下是一个模拟的研究方案,使用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除: 假设研究目标 研究特定基因(例如,基因X)在癌细胞增殖中的作用。 材料和方法 1.设计sgRNA: 使用在线工具(如CRISPR Design Tool)针对基因X设计sgRNA序列。 合成sgRNA并验证其序列正确性。