1、测序验证 提取阳性单克隆细胞株的基因组,将靶标基因酶切克隆至T载体后测序,以确定是否敲除成功。 实验结果示例: 该基因有两个单克隆细胞株,A1和A2。 单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式,分别缺失1个和19个碱基,在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。 单克隆细胞A2的目的基因...
随着CRISPR/Cas9技术的不断发展,该技术已广泛应用在各物种中,卡梅德生物可以提供高质量的CRISPR/Cas9敲除细胞系构建服务,同时还有基因敲除、过表达、沉默、定点整合等各种类型基因编辑服务,效率高、系统稳、脱靶低、性价比高,服务透明化。
即非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源介导的修复(Homology-directed repair, HDR),而基因敲除则利用的是NHEJ的修复方式,在Cas9切割诱导DNA双链的断裂后,细胞启动NHEJ修复机制,在修复过程中通常会发生碱基插入或
27. 将扩增后的稳定敲除细胞进行冻存。 服务推荐 凭借多年的经验和稳定的平台,安必奇生物科技提供各种CRISPR/Cas9相关服务,以帮助您在不同阶段进行基因编辑。我们的服务涵盖sgRNA设计、转染、筛选,再到最终细胞系。我们的服务包括细胞系定制服务,细胞永生化服务,微生物基因组改造,植物CRISPR/Cas9基因编辑,植物CRISPR单碱...
图1. CRISPR基因敲除细胞系实验步骤概况。 实验步骤 sgRNA和genotype primers的设计合成 sgRNA设计:对靶基因序列进行分析,筛选合适的靶位点,每个靶位点设计1条sgRNA。通常,将Cas9靶向编码功能蛋白结构域外显子的sgRNA比单纯靶向5'外显子更有可能消除基因功能。
恒一生物科研技术团队已全面推出构建CRISPR/Cas9敲除细胞系服务,并构建了小鼠消化道上皮细胞、小鼠前脂肪细胞、小鼠肝细胞以及猪、奶牛、羊消化道上皮细胞和乳腺上皮细胞等相关基因敲除的细胞系构建。 CRISPR/Cas9简介 CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制,此系统成功被改造为第三...
基因敲除技术优势 Cas9X使用新的实验模型将细胞系的敲除效率进行大幅的提升 1. 使用Cas9蛋白和gRNA的复合物直接进行电转,提高效率的同时减少非特异的切割;(目前报道脱靶率最低的方法)2. 使用高效的电转设备,具备更高的电转效率和细胞存活率;3. 使用更先进的单克隆稀释设备和方法,大幅提高阳性率;(提高2倍...
通常使用质粒载体或病毒载体等方法来将Cas9和sgRNA导入细胞。目前慢病毒是构建基因敲除细胞株的最佳工具,通过将编码Cas9蛋白的序列和sgRNA序列克隆至慢病毒穿梭质粒中,再用包装好的病毒感染细胞。4.实验细胞感染及基因敲除 利用慢病毒感染实验细胞,细胞成功表达Cas9和sgRNA。Cas9蛋白在sgRNA引导下对细胞基因组的靶标基因...
一、基因敲除原理 Cas9可以对靶基因组进行剪切,形成DNA的双链断裂。在通常情况下,细胞会采用高效的非同源末端连接方式(NHEJ)对断裂的DNA进行修复。在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象,造成移码突变,(移码突变:是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入,引起阅读框架变化,造成下游的一系列密码改变,使原来编...
(11)通过设计引物,进行PCR,检测基因是否敲除 (12)为进一步验证,将PCR产物送去Sanger测序 6. 将敲入正确的多个单克隆进行扩增并冻存 需要注意的是尽可能多留几株不同的单克隆,以免某些单克隆的细胞特征与WT细胞差异过大。(一般文章中会使用3个不同的单克隆)本期内容针对CRISPR-Cas9基因敲入系统(knock in...