图9 基于碱基编辑器的筛选 Cas9 screen技术是一项极具潜力的高通量筛选工具,已被应用于各个领域。同时,其衍生与拓展技术,如Cas13 screen、Base editor screen也逐步问世。我相信未来的研究手段一定是从杂乱走向整合、从非系统性走向系统性、从低通量走向高通量的,因此类似Cas9 screen的技术在未来一定大有可为。 参考...
CRISPR/Cas9基因编辑技术不仅可以对基因组进行编辑,还可以对基因组进行活细胞成像,即在仅有靶向性而无切割活性的Cas蛋白后面融合一个绿色荧光蛋白实现特定基因位点的标记。 2016年,Hanhui Ma利用在gRNA 3’端融合了不同的RNA适配体,包括MS2、PP7、boxB(如下图15),将红、蓝、绿三种荧光蛋白连接在RNA适配体相对应的...
近年来,许多高水平文章报道了通过该方法发现参与各种生物学过程的新基因。而针对lncRNAs的高通量文库在2018年才有报道(Liu, Cao et al. 2018)。接下来让我们来学习整个实验的设计思路。 图1 CRISPR-Cas Screen文库构建、感染和筛选模式图 如图1所示,...
MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 2018;24:966–81. Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, Smith I, Tothova Z, Wilen C, Orchard R, et al. Optimized sgRNA ...
CRISPR/Cas是一种能够精确切割靶DNA的可改造核酸内切酶系统，通常由编码核酸酶的Cas蛋白和用于靶向的引导RNA（gRNA）两部分组成。对于大规模的基因编辑，编辑工具必须是高效和稳定的。目前已经发现几种基因编辑工具适合在植物中进行CRISPR screen。在植物中用于CRISPR筛选的最常用的核酸酶是SpCas9。SpCas9通常由位于5'-...
图1 CRISPR-Cas Screen文库构建、感染和筛选模式图 如图1所示,我们首先需要设计或购买符合我们研究目标的sgRNA文库。例如Addgene 89640、86538–86550、1000000106等,都十分方便研究者直接使用。这些文库针对每一个lncRNA均设计6条sgRNA来提高结果的准确性。然后包装病毒后感染细胞建立稳定表达相应Cas9蛋白和gRNA的细胞系。
A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors Nat Genet, 49 (2) (2017), pp. 193-203 CrossrefView in ScopusGoogle Scholar Park et al., 2015 J. Park, S. Bae, J.-S. Kim Cas-Designer: a web-based tool for choice of CRISPR-Cas9 target sites...
目前,应用最最广泛的工程设计CRISPR/Cas体系由 Cas9核酸酶和单链引导RNA (sgRNA)组成。引导 RNA (sgRNA) 是一段长度为20bp的核糖核酸序列。sgRNA通过Watson-Crick碱基互补配对原则和基因组上的某一段序列结合,并将Cas9蛋白引入这个位点,因为Cas9蛋...
CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 来识别并剪切 DNA 以降解外来核酸分子。现在使用的 CRISPR/cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来,该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。 CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA(guide RNA)来识别目的基因组序列,并引导 Cas9 蛋白...
所有这些不确定因素导致CRISPR screen的结果非常dirty,SOX9和KRT20本身因为是直接的Target,所以富集也毫无意外,其他的间接的则没有那么明显。 所以,我的结论:目前该lab对CRISPR screen的理解和掌控其实是在非常肤浅的程度,数据基本无法利用。 如果是我,我会首先无脑加大样本量,去掉所有复杂的设计(这套系统准确度根本就...