⾸先需要说明的是，熟悉了解免疫共沉淀实验的原理及实验的操作流程是进⾏Co-IP结果图分析 的前提。在清楚知道Co-IP操作流程的前提下，弄清楚图中各个部分所代表的实验步骤，结合图 中展⽰的结果进⾏分析，便可以看懂Co-IP的实验结果图。Co-IP结果分析案例⼀ 该图为验证蛋⽩EDR1与蛋⽩EDR4之间是否...
Co-IP 流程 (以内源性 Co-IP 为例)[1]1样本准备采用适当的方法收集细胞，使用含有合适的蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。2固相介质准备将含有保护液的蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖混匀取出，用平衡液清洗磁珠/琼脂糖凝胶。3预清洗 (可选)将细胞裂解液或已预处理的样本用蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/...
NaF: 1 mM 三、实验流程: (1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清; (2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4℃缓慢摇晃孵育过夜; (3)取10μl protein A 琼脂...
Co-IP实验基本过程包含四步:1、非变性蛋白提取物中添加抗体(IP级别抗体);2、目标蛋白被抗体免疫特异性沉淀/结合;3、抗体与磁珠(含Protein A/G/其它)偶联;4、分离蛋白复合物 [5]。 (图1 蛋白复合物免疫共沉淀(Co-IP)法) 3 Co-IP实验实操 3.1 Co-IP实验过程 (1)过表达感兴趣的蛋白质粒 很多时候,通过过...
实验流程 Co-IP方案与传统IP方案非常相似,不同之处在于Co-IP需要更温和的检测条件来维持与结合伙伴的相互作用。接下来以protein A/G琼脂糖珠法为例,介绍基本实验流程: 1.样本制备 离心收集细胞后,加入适量预冷的非变性细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂,冰上静置15-30min,充分裂解细胞,4℃离心后取上清 ...
因此，Co-IP的实验步骤可大致概括为以下4步：（1）裂解蛋白，得到蛋白的混合物；（2）将靶蛋白的抗体与蛋白混合物共同孵育；（3）洗脱，得到拉下来的蛋白；（4）再将拉下来的蛋白当作样本，用其互作蛋白的抗体进行检测。图1 Co-IP实验原理及流程（伯远生物科研绘图）。Co-IP结果如何看？虽然了解过Co-IP的原理...
除此之外CO-IP实验还会设置一个阳性对照组（Input组），Input组为直接利用抗体X（抗体Y）对细胞裂解液进行WB检测，验证细胞裂解液中存在蛋白X(抗体Y)。在某些CO-IP实验中，实验人员会把IP后的上清分别进行蛋白X和蛋白Y的WB检测，该对照组称为output组。免疫共沉淀的实验流程 免疫共沉淀实验流程为：收集蛋白样品—...
IP-MS的实验流程如下图所示，包括：（1）材料获取：细胞或组织。（2）蛋白提取：可根据目的蛋白的特性加入不同类型的IP裂解液及抑制剂。如：非磷酸化蛋白可不添加磷酸酶抑制剂；IP背景高，选用裂解度高的裂解液；目的蛋白IP不下来，选用裂解度低的裂解液等。（3）Beads结合抗体孵育：对应的抗体与Beads结合，注意...
实验流程 1.培养实验所需细胞2.外源性CO-IP需要转染外源质粒3.细胞裂解（常用RIPA并添加PMSF等酶抑制剂）4.免疫沉淀反应 ①磁珠预处理（protein A/G或HA等标签磁珠）②目标抗体与磁珠结合（一般抗体使用浓度为10-50ug/mL）③抗原沉淀反应（含有抗体的磁珠与细胞裂解液结合）④抗原洗脱（变性和非变性两种）⑤WB...