取与IP实验等量的裂解液,使用Isotype Control孵育;与IP抗体孵育同时进行。 Isotype Control选择: 预纯化的目的: 减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。 同时减少了可能与Protein A/G发生交叉反应的蛋白含量。 根据IP实验结果,可以调整每次IP的总蛋白用量。 预纯化流程: 取200 μL 1 mg/mL的细胞裂解物与30μL ...
4. 将预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h...
免疫共沉淀 Co-IP 实验操作步骤 一、原理: 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础 的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用 的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下...
除此之外CO-IP实验还会设置一个阳性对照组（Input组），Input组为直接利用抗体X（抗体Y）对细胞裂解液进行WB检测，验证细胞裂解液中存在蛋白X(抗体Y)。在某些CO-IP实验中，实验人员会把IP后的上清分别进行蛋白X和蛋白Y的WB检测，该对照组称为output组。免疫共沉淀的实验流程 免疫共沉淀实验流程为：收集蛋白样品—...
因此，Co-IP的实验步骤可大致概括为以下4步：（1）裂解蛋白，得到蛋白的混合物；（2）将靶蛋白的抗体与蛋白混合物共同孵育；（3）洗脱，得到拉下来的蛋白；（4）再将拉下来的蛋白当作样本，用其互作蛋白的抗体进行检测。图1 Co-IP实验原理及流程（伯远生物科研绘图）。Co-IP结果如何看？虽然了解过Co-IP的原理...
实验流程 Co-IP方案与传统IP方案非常相似,不同之处在于Co-IP需要更温和的检测条件来维持与结合伙伴的相互作用。接下来以protein A/G琼脂糖珠法为例,介绍基本实验流程: 1.样本制备 离心收集细胞后,加入适量预冷的非变性细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂,冰上静置15-30min,充分裂解细胞,4℃离心后取上清 ...
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实验原理 实验流程 1.培养实验所需细胞2.外源性CO-IP需要转染外源质粒3.细胞裂解（常用RIPA并添加PMSF等酶抑制剂）4.免疫沉淀反应 ①磁珠预处理（protein A/G或HA等标签磁珠）②目标抗体与磁珠结合（一般抗体使用浓度为10-50ug/mL）③抗原沉淀反应（含有抗体的磁珠与细胞裂解液结合）④抗原洗脱（变性和非变性两种...
一般实验流程 1、 样本制备：离心收集细胞后，加入适量预冷的非变性细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂，冰上静置15-30min，充分裂解细胞，4℃离心后取上清；2、 诱饵蛋白抗体孵育：取少量细胞裂解的上清以备western blot分析，其余的上清液加入相应蛋白的抗体（适用于IP），置于4℃摇床孵育过夜。3、 沉淀免疫复合物...
1.co-ip实验的原理 co-ip实验的核心原理是利用特异性抗体将目标蛋白及其相互作用伙伴从复杂的细胞或组织提取物中共同沉淀下来。具体而言，该方法包括以下步骤：（1）细胞裂解和蛋白质提取；（2）抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物；（3）将免疫复合物与亲和基质（如蛋白A/G琼脂糖珠）结合，实现蛋白质的富集；（4）...