方案三:标签类(Flag,HA,GFP,myc等)IP通过过表达方式,将目标IP蛋白带上Flag,HA,GFP,myc等标签,可极大方便后续的实验检测。 ①可直接选择现成的Flag beads或者磁珠,IP实验会比较容易操作,由于标签抗体非常成熟,IP抗体与WB抗体选择不同种属来源,即可避免轻重链问题。 ②WB选择直接HRP标记的标签抗体(如Flag-HRP mab)...
Western Blot 或质谱检测分析沉淀的诱饵蛋白及与其结合的靶标蛋白。 小贴士: 内源性 Co-IP 实验可选择蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖;外源性 Co-IP 实验中蛋白携带标签 (如 Flag、HA、c-Myc、GST 等),可以选择标签抗体类磁珠/琼脂糖凝胶珠 (如 Anti-Flag 磁珠、Anti-HA 磁珠、Anti-c-Myc 磁珠、Anti...
最后观察CO-IP实验组,该组图表示在IP组的基础上进一步利用anti-GFP检测GFP标签,图上显示第一组实验没有条带,而第二组实验在130kd处有蛋白。说明IP组没有把GFP标签共沉淀下来,但是把EDR4-GFP蛋白共沉淀下来了。说明EDR1-FLAG蛋白不能与GFP标签相互作用,但是可以与EDR4-GFP蛋白相互作用,由此可得到结论:EDR1蛋白...
③羊驼标签beads(也称纳米抗体beads),由于羊驼抗体结构的特殊性,可完全避免IP上的轻重链问题,劣势是成本较高。 8)实验过程回顾 作图中的常用表示 Input:就是验证所制备的蛋白样品有没有问题,这个样品不需要挂磁珠,上磁珠之前就需要吸一部分样品出来做Input做wb检测,一般杂内参抗体,A抗体和B抗体,因为只有AB蛋白在这...
Co-IP 阴性对照:排除非特异结合的情况 只加入beads不加入IP抗体; 加入同型IgG作为IP抗体对照(常用); 加入标签空载组/空白对照组(常用); 使用不表达靶蛋白但表达另一相互作用蛋白的样品做对照。 阳性对照(Input对照) 细胞或组织样本裂解物,预留样本,含有靶蛋白和预测相互作用蛋白。
Co-IP实验是一种常用的蛋白质分析方法,在生物医学和基础研究中具有广泛应用价值。该方法可以用于研究蛋白质相互作用及其互作位点、信号转导途径、细胞周期、疾病机制、病原及药物靶点等方面的问题。 应用实例:(疾病机制) 2023年湖北医科大学的郭兴荣团队在期刊Journal of Advanced Research上发表了题为“ANGPTL8 accelerate...
在解析Co-IP结果时，首先需理解免疫共沉淀的基本原理与操作流程。了解实验步骤后，仔细分析实验结果图，按照Co-IP实验的顺序进行。例如，图一展示了EDR1与EDR4之间可能的相互作用。EDR4带有GDP标签，EDR1带有FLAG标签。实验分为两组，一组带有GFP标签及EDR1-FLAG蛋白，另一组带有EDR4-GFP蛋白及EDR1-...
Co-IP结果分析案例⼀ 该图为验证蛋⽩EDR1与蛋⽩EDR4之间是否存在相互作⽤的结果图。由图中可以得到，蛋⽩ EDR4带有GDP标签，蛋⽩EDR1带有FLAG标签，该实验为利⽤蛋⽩标签来沉淀和检测蛋⽩；该co-ip实验实验被分为两组，第⼀组存在GFP标签及EDR1-FLAG蛋⽩，第⼆组存在EDR4- GFP蛋⽩及...
或者直接选用相关标签蛋白抗体凝胶/磁珠。IP实验中常见的常见问题包括裂解液中去垢剂浓度过高或配方过于剧烈，可降低此类去垢剂浓度或更换去垢剂；受蛋白的亚细胞定位影响，应重新选择裂解液配方以释放目的蛋白；蛋白与蛋白之间相互作用太弱或不稳定。免疫共沉淀实验失败的原因有哪些？
此外,伊莱瑞特具有更加便捷的标签抗体亲和凝胶,能预先将标签抗体与凝胶/磁珠共价偶联(如EA-IP-001),大大减少IP实验的操作流程。利用免疫磁珠,甚至能比传统IP实验缩短1-2h时间! 免疫共沉淀 免疫共沉淀(Co-IP),是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础、用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内...