普通逆转录 qPCR引物设计里一个很重要的原则是引物序列要跨内含子,目的就是把cDNA模板和genomic DNA模板区分开来,避免引物结合到残留的genomic DNA模板上,导致假阳性非特异性扩增信号。 而在ChIP-qPCR的引物设计中,则不需要这样,如果这样做,对有些组蛋白修饰的位点反而检测不出来了。因为ChIP-qPCR使用的模板就是来自...
引物设计Tips 1. TF结合的区域通常是启动子,UTR这些A/T比例比较高的区域,因而如果设计出来的引物Tm值略低,也是正常的,只要可以保证引物的特异性,不必强求退火温度比Tm低5度。 2. qPCR的产物长度一般不要太长,80-150bp就可以,因为在ChIP实验中染色质被片段化,你的PCR扩增的片段越长,这段DNA被打断的可能性就...
Active Motif提供一些现成的经过验证的ChIP-qPCR Control Primer Sets(如下图),可以作为阴性对照引物或阳性对照引物直接使用,也省去各种检验的麻烦,更多产品信息可登陆官网查看或联系我们咨询。 04 如果您缺乏相关的ChIP-Seq数据作为参考,仍然有一些小的技巧可以帮助您设计引物。 看看你买ChIP抗体的公司网页,是否有ChIP...
经过成千上万次的ChIP-qPCR,CST 科学家给出了Q-PCR标准质控: 1)组蛋白H3阳性对照相对input富集丰度正常值在1%-5%左右; 2)阴性对照IgG相对input富集丰度应低于0.1%。 3)当靶标抗体在目标基因位点的相对富集丰度,相比于非目标基因位点(或阴性对照引物)的富集丰度比值超过3倍,相对于阴性对照IgG的相对富集丰度比值达...
qPCR的结果最终以柱状图的形式展示出来,如下图例: 该图中,分别用IgG与CTCF抗体孵育,其中IgG抗体为阴性对照组,比较两者富集H19/gap in8/myo-ex DNA的能力,其中H19为阳性对照DNA, myo-ex为阴性对照DNA。 ChIP技术的应用 染色质免疫...
这时,如果一定要做阳性对照,还可以采用另一个方案,使用阳性抗体histone H3抗体配合靶基因的特异性引物来做PCR,因为任何靶基因都有组蛋白的结合,所以histone H3抗体免疫沉淀下来的DNA用靶基因引物做PCR也肯定会产生阳性信号。 特别提醒: ChIP-qPCR和普通逆转录-qPCR的引物设计有很大不同。
在有peak富集的区域选择DNA序列用来设计阳性对照的引物。对于你感兴趣的结合位点,可以先定位到基因,再根据ChIP-Seq的数据选择有peak富集的区域。 获得DNA序列了,就可以进一步利用Primer 3等软件进行qPCR引物的设计,用Blast检验引物特异性。 对于阴性对照的引物,可按照同样的方法,选择没有Peak富集的区域进行设计。
样本内对照(Input管、IgG管、Anti-target管)在做ChIP-qPCR实验中,同一个样本需要分成3份(Input管,IgG管,Anti-target antibody管),准确说是4份,因为每个样本都需要额外取一点用于DNA片段化情况的质控。Input管是按照一定比例分出的原始样本(在ChIP中是指断裂后的原始基因组DNA片段混合物,未进行抗体结合)...
选择在三组数据中都有 peak 的区域,Zoom In。在有 peak 富集的区域选择 DNA 序列用来设计阳性对照的引物。对于你感兴趣的结合位点,可以先定位到基因,再根据 ChIP-Seq 的数据选择有 peak 富集的区域。 获取DNA 序列 获得DNA 序列了,就可以进一步利用 Primer 5 ...
样本内对照(Input管、IgG管、Anti-target管) 在做ChIP-qPCR实验中,同一个样本需要分成3份(Input管,IgG管,Anti-target antibody管),准确说是4份,因为每个样本都需要额外取一点用于DNA片段化情况的质控。Input管是按照一定比例分出的原始样本(在ChIP中是指断裂后的原始基因组DNA片段混合物,未进行抗体结合),一般采用...