许多老师在做完ChIP-seq分析后,通常会找到感兴趣的TF/组蛋白修饰的1个或多个靶基因。为了进一步证实TF/组蛋白修饰与靶基因的结合状态,需要通过不同的技术进行验证。ChIP-qPCR因其体内富集(相比体外实验)能够更真实地反映结合状态的特性,被众多老师青睐。 目前ChIP有两种定量方式,分别为“双△CT法”以及“双标准曲线...
染色质免疫沉淀(ChIP)实验通过组蛋白修饰(表观遗传学)或转录因子-DNA 结合相互作用,监测转录调控,识别基因组和蛋白质组之间的联系。ChIP 实验的优势在于能够捕捉系统中特定蛋白质-DNA 相互作用,并使用定量聚合酶链反应(qPCR)对相互作用进行量化。染色质免疫...
作为一种研究蛋白质与DNA相互作用的技术，ChIP可以完整真实地反映细胞中特定蛋白与DNA的结合关系，它通过多种蛋白质组学和分子生物学方法，包括交联、细胞裂解（蛋白质-DNA提取）、核酸剪切、抗体免疫沉淀、DNA样本回收，将蛋白-DNA复合物分离出来进一步研究特定的结合蛋白或与其结合的DNA，同时结合qPCR（ChIP-qPCR）可用...
如果你想采取一种无偏差的方法，并需要确定基因组中转录因子或组蛋白修饰的所有位点，NGS测序更适合一些。
ChIP-qPCR和普通逆转录-qPCR的引物设计有很大不同。 普通逆转录 qPCR引物设计里一个很重要的原则是引物序列要跨内含子,目的就是把cDNA模板和genomic DNA模板区分开来,避免引物结合到残留的genomic DNA模板上,导致假阳性非特异性扩增信号。 而在ChIP-qPCR的引物设计中,则不需要这样,如果这样做,对有些组蛋白修饰的位...
染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究目的蛋白在染色质上定位的技术。ChIP 的原理是通过甲醛处理细胞固定 DNA 和蛋白，然后提取染色质，使用超声或酶解将染色质剪切成小片段。之后使用结合在染色质的目的蛋白或组蛋白修饰特异性抗体富集 DNA 片段。富集的 DNA 片段可以通过 PCR，DNA ...
图1 组蛋白结构。常见的组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，图2展示了各个组蛋白中的修饰情况(Huang et al., 2014)。组蛋白发生修饰后会使染色质的构象等发生变化，从而影响了DNA与组蛋白之间的相互作用，进而调控基因的转录表达。图2 组蛋白修饰(Huang et al., 2014)。由于组蛋白修饰的类型众多...
ChIP-qPCR和普通逆转录-qPCR的引物设计有很大不同。 普通逆转录qPCR引物设计里一个很重要的原则是引物序列要跨内含子,目的就是把cDNA模板和genomic DNA模板区分开来,避免引物结合到残留的genomic DNA模板上,导致假阳性非特异性扩增信号。 而在ChIP-qPCR的引物设计中,则不需要这样,如果这样做,对有些组蛋白修饰的位点...
(1)目标基区域转录因子结合/组蛋白修饰的验证:CHIP-qPCR (2)检测目标基因的mRNA表达水平:RT-qPCR (3)检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot 二、转录因子或组蛋白修饰添加基因的干扰实验(非靶向),验证是否影响目标基因表达和细胞功能 (1)转录因子或组蛋白修饰添加基因的干扰:基因的突变/敲降/敲除/过表达、相关...