除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA片断——PCR分析。
按照下面公式计算ChIP富集效率: Percent Input = 2% x 2(C[T]2%Input Sample– C[T]IP Sample) 而IgG抗体IP后的DNA作为模板进行定量PCR反应获得的Ct值,作为阴性对照来衡量目的蛋白组的抗体富集是否达到显著差异,是否可以作为可信的结果。 通常,当抗体对特定基因位点(例如转录因子结合到目标启动子)的富集相对于用...
(1)如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列是目的蛋白的靶序列,可以根据靶序列设计引物,用荧光定量PCR的方法,比较特异性和非特异性免疫抗体所沉淀的DNA的PCR产物的量,或者比较根据靶序列设计的引物和远离靶序列设计的引物的PCR产物的量。比值越大,则说明靶序列DNA与目的蛋白相结合的可能性越大。 (2)如果目...
PCR 反应应当包括靶蛋白抗体Anti-target IP样品、阴性对照 Normal Mouse/Rabbit IgG样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的空白对照和 1% 输入对照Input组染色质 DNA 的连续稀释物(未稀释、1:5、1:25、1:125),以生成标准曲线并测定扩增效率(扩增效率的测定是可选做的)。 向PCR 平板上的每管或每孔中添加2 ...
ChIP实验步骤可分6步: 细胞的甲醛交联与超声破碎; 细胞裂解,除杂及抗体哺育; 分出一半用酚/氯仿抽提,电泳检测超声效果; 免疫复合物的沉淀及清洗; DNA样品的回收; PCR分析,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了...
2)如果下游衔接的是荧光定量PCR,那么DNA片段长度集中在300-1000 nt左右更好。 MNase酶切染色质后得到的DNA小片段的电泳条带图 上图为使用MNase酶切染色质后得到的DNA小片段2%琼脂糖电泳后的条带图 超声打断染色质后得到的DNA小片段的电泳条带图 上图为使用超声打断染色质后得到的DNA小片段(经过不同超声条件的优...
双△CT法简单介绍 双△CT法也称为2-△△CT法，将PCR的数据转换成CT值（即qPCR反应荧光信号首次到达...
ChIP实验的基础步骤是使用甲醛溶液将DNA和作用蛋白交联固定在一起后,提取染色质 并将染色质剪切到一定的片段大小,再用染色质蛋白特异性抗体,通过免疫沉淀富集感兴趣 的染色质片段。 最初检测感兴趣的DNA是通过固定在硝化纤维素上并用与目标位点互补的DNA探针分析ChIP结果,这种方法限制了ChIP技术的灵敏度,因此基于PCR的...
甲醛处理细胞 → 收集细胞,超声破碎 → 加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合 → 加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀 → 对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合 → 洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物 → 解交联,纯化富集的DNA-片断 → PCR分析。
Q-PCR 定量分析:适合单个或少数已知结合位点的q-PCR分析;需设计靶点基因的特异引物,通过引物扩增的Q-PCR方法定量特异基因富集水平;Q-PCR 分析即用定量PCR 仪自带的程序分析定量结果,CST 建议,需对靶蛋白抗体和抗体对照(H3#4620; IgG#2729)和引物对照(Human RPL30 Primers#7014; Mouse RPL30 Primers#7015)分别...