gRNA (或称向导 RNA)是 CRISPR-Cas9 系统的一部分。gRNA 分子有两个组分:一个靶点特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一个辅助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通过 20-mer crRNA 序列与靶基因组序列之间的碱基配对,引导Cas蛋白复合物对相应位点进行切割,决定编辑位点特异性。 什么是SgRNA? sgRNA 代表单向导 R...
On-Target ScoregRNA活性得分，即Cas9在由gRNA靶序列指定的所需位置进行切割。PAM - Protospacer Adjacent...
1. 质粒瞬转体系: 采用gRNA表达质粒和Cas9表达质粒(或者采用gRNA+Cas9共表达质粒)共转染细胞,在细胞内通过质粒瞬时表达gRNA和Cas9蛋白,进而实现对靶基因的编辑。 2. RNA瞬转体系: 首先在体外合成gRNA和可以表达Cas9蛋白的mRNA,然后通过瞬时转染技术将两者递送到细胞内,由...
On-Target ScoregRNA活性得分，即Cas9在由gRNA靶序列指定的所需位置进行切割。PAM - Protospacer Adjacent...
是否提供两部分合成 gRNA? sgRNA 代表单向导 RNA,与传统的天然化脓性链球菌 CRISPR-Cas9 系统不同,其使用两部分向导,其中 CRISPR RNA (crRNA) 与 tracrRNA 杂交。sgRNA 将两个 RNA 结合成单个长 RNA。sgRNA 的长度通常为 100 nt,可以从载体表达或化学合成。 由于与双部分 gRNA相比,修饰的 sgRNA 在更多类型的...
CRISPR/Cas9系统是利用一段与靶序列互补的gRNA引导cas9核酸酶对特异靶向的DNA进行识别和切割,造成双链DNA断裂,然后细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复,即非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源介导的修复(Homology-directed repair, HDR),而基因敲除则利用的是NHEJ的修复方式,在...
gRNA的开关 CRISPR/Cas9技术的一个主要缺点是大多数表达系统始终在“开启”状态。没有在特定时间关闭或打开切断的机制,要是能在特定阶段打开或关闭就好,比如像热启动PCR中的抗体修饰。 gRNA修饰的最新进展已经用可光激活和可光切割的gRNA克服了这些问题,通过在gRNA的20 nt靶向区域引入单个可光切割的2-硝基苄基接头来...
Cas9gRNA载体构建试剂盒(CR5002) pCas9gRNA7是在前代载体的基础上反复优化得到的Cas9sgRNA共表达载体。由于采用了高特异性Cas9突变体和高效sgRNA,载体的脱靶率显著降低,靶点切割效率和野生型Cas9近似。现在已经应用pCas9gRNA7载体在多种细胞成功实现了基因敲除、敲入以及定点突变等多种基因编辑实验。
手动设计gRNA步骤: 明确Cas蛋白及其对应PAM序列 SpCas9 =NGGORCCN 在目的基因片段中找到PAM序列; 选取PAM序列5‘端的20个核苷酸(不包含PAM); 检测序列的特异性(blast):在基因组层面对gRNA进行比对; 检查一下gRNA的5’端是否为“G”,如果没有的话就在5’端加一个G; ...
在线设计gRNA的工具 一、着重推荐Lei Stanley Qi Lab的http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp 这个在线站点功能比较丰富,可以选择基因编辑工具的其他用途(激活,抑制基因表达等)(如上图所示)。下一步就是选择物种。但只有常见的9种。再下一步...