一、样品准备：1、质粒转染细胞 （1）细胞铺板：将细胞按50%的密度接种到细胞培养12孔板内。（2）转染：16h左右细胞约70%时转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置3个复孔。首先设计四组：空白组（转染试剂+细胞）质粒组 质粒+miRNA NC组 质粒+miRNA mimics组 ● 配制质粒组：按照每空50ng质粒，同时每孔20ul...
3.关键基因验证：对筛选出的关键基因进行进一步的验证，包括定量验证、定性验证、基因功能验证以及基因调控...
利用荧光素酶报告基因检测实验寻找或验证microRNA对靶点作用性是不可或缺的实验技术。中洪博元可为您提供microRNA报告基因载体构建服务，并可进一步为您提供荧光素酶报告基因检测实验服务。您只需要提供目的microRNA靶位点序列，我们专业的技术服务人员就可替您完成载体构建，为您节省大量的时间和精力。下图为双荧光素酶...
转录因子是一类能够调控基因转录活动的蛋白质,它与特定DNA序列结合,控制下游基因的开启与关闭,从而调控基因的表达。在前期的文章中我们已经介绍了很多关于根据转录因子找到目标靶基因的方法,例如ChIP-seq、CUT…
1、在网页在线搜索https://www.targetscan.org/vert_80/, 进入在线预测网站如图1所示,网站首页包括所预测miRNA的所属物种,筛选的限定选项等;另外通过这个网站我们还以根据已知的靶基因来预测未知的miRNA的结合位点,即输入需要预测的基因名或者输入ENST编号,将显示预测该基因的所有miRNA位点。
最近进行课题设计,想验证一下microRNA和预测的靶基因是否结合。同时在靶基因3‘-UTR区的SNP是否影响它们的关系。这个SNP位点在种子区,推测也具有一定功能。第一步想克隆microRNA到表达载体,同时克隆3’-UTR区(包括野生型和突变型)到PGL-3 control 荧光素酶基因下游,双转细胞后,利用荧光素酶报告系统检测两者是否结合...
萤光素酶可以催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin,在 luciferin 氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence),可通过荧光测定仪设备测定 luciferin 在氧化过程中释放的生物荧光,常应用于启动子转录活性调控及 miRNA 靶基因验证等方向的研究。 萤光素酶的两个应用: ...
1. 获取靶基因启动子 这里我们主要使用NCBI数据库查找基因启动子序列，一般认为启动子位于基因转录起始位点上游2000bp的范围，这里以人源的CD274为例，查询操作如下：在NCBI搜索CD274的基因信息。点进去后下拉到“genomic context”看到CD274在基因组中的方向为正向。这里需要注意基因转录方向是正向还是反向，这一点与...
microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因验证实验 环状RNA(circRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)是一类非编码RNA,不翻译蛋白。但在细胞中它们能够调控其他基因的表达变化。近年的研究表明circRNA和lncRNA分子富含microRNA结合位点,在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用,进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用,升高靶基因的表达水平...
通过靶向干扰转录因子的表达,观察其对靶基因表达水平的影响,可以评估转录因子的功能。这种方法通过干扰转录因子的表达,直接验证其在调控下游靶基因中的作用,但需要设计合适的RNA干扰实验方案,并考虑到靶基因表达的调控网络。 4. EMSA技术分析转录因子结合DNA的特异性 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)是一种用来...