选择合适的抗体是 ChIP 实验成功的关键步骤。对于哺乳动物样本,有许多 ChIP 级抗体可用于该步骤的验证。对于无法获得合格抗体的靶蛋白,可在生物样品中表达 HA、myc 或 GST 等融合蛋白,然后利用针对亲和标记的抗体对靶蛋白进行免疫沉淀。 抗体-蛋白质-DNA ...
1）取上述50μl离心后的裂解液上清加入到新的离心管中，作为一次免疫沉淀实验的DNA混合物样本。每50μl 裂解液中含有1×106个细胞裂解产物。ChIP反应包括阳性对照抗体管、阴性对照IgG管和目的蛋白抗体管。推荐阴性对照IgG和目的抗体使用同一物种来源。2）在上述50μl片段化染色质样品的离心管中加入上述配制好的450μ...
通常,当抗体对特定基因位点(例如转录因子结合到目标启动子)的富集相对于用相同抗体对非特定基因位点(例如相同转录因子结合到非目标启动子)的富集要高至少4倍,相对于用Normal RabbitIgG #2729进行的特定基因位点的富集要高至少5到10倍时,我们定义ChIP结果为阳性。阳性ChIP实验可低至总input染色质的0.5%(例如转录因子和...
2. 留取 300ul 做实验,其余保存于-80℃。 3. 300 ul 中,100 ul 加抗体做为实验组;100 ul 不加抗体做为对照组;100 ul 加入 4 ul 5 M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2 M),65℃处理 3 h 解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。 4. 在 100 ul 的超声破碎产物中,加入 900 ul ChIP DilutionBuffer 和 20 ...
实验步骤 一、细胞的甲醛交联与超声破碎(第一天) 1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5 min即可。 4. 吸尽培养基,用冰冷...
🛠️ChIP实验步骤如下: 1️⃣ 细胞的甲醛交联与超声破碎:使用甲醛将染色质上的DNA和目的蛋白交联,然后通过超声或酶解将染色质片段化。 2️⃣ 细胞裂解、除杂及抗体哺育:裂解细胞并去除杂质,然后加入特异性抗体与目的蛋白结合。 3️⃣ 免疫复合物的沉淀及清洗:通过抗体将包含目的蛋白的染色质片段富集...
洗涤步骤:充分的洗涤是去除非特异性结合的关键步骤,保证实验的特异性。交联时间:交联时间的过长可能导致染色质的过度固定,影响后续的DNA提取。质控实验:包括负对照和阳性对照,以验证实验的有效性和特异性。实验重复:为了确保结果的可靠性,建议进行多次独立的实验。遵循这些注意事项,ChIP技术可成功应用于研究蛋白质与染色...
9 加入100μl ChIP清洗缓冲液,62℃振荡孵育2 h 10 95℃孵育10 min。然后将样品置于室温冷却。 11 将样本置于磁力架上,将上清液移到一个新的管子中。 3、DNA纯化 1将0.5 ml Bind Reagent A加入每个100 μl的DNA样品管中并混匀。将样本转移至离心柱上管中,12000rpm离心1min。去除下管液体。