a )引物的5\\\'端可以修饰,而3\\\'端不可修饰 b )引物的5\\\' 端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5\\\'端修饰包括:加酶切位点,加标记荧光,引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等...
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A(3’ 端碱基序列最好是G、C、CG、GC),因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR 影响不大,因此常用来引进修饰位点或标记物。 3. 引物的GC含量一般为40-60%,...
引物的3’端决定着PCR反应产物的特异性，而5’端限定着PCR产物的长度。（1）引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配，特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配...
【5】引物的3’端要与模板严格配对,而5’端碱基没有严格的限制,只要与模板DNA结合的部分足够长,其5’端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态,这样,我们可以在引物的5末端加上酶切位点(引入酶切位点时,要考虑到进行双酶切的共用缓冲液,否则给下游工作带来困难)、启动子,方便下游操作。 【6】不要在扩增序列的...
2.高GC含量:引物的GC含量应高于50%,以增加引物与目标序列的稳定性和特异性。 3.避免酶切位点:在引物设计过程中,应避免引物与目标序列中的酶切位点重叠,以防止扩增产物的酶切降解。 4.引物长度:引物的长度通常在18至30个核苷酸之间,过长的引物会降低特异性,而过短的引物则可能导致非特异性扩增。 5.引物的Tm...
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。
5. 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 6. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不...
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当...
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。 引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形...
8、引物5'端和中间△G值应该相对较高,而3'端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。应当选用5' 端和中间△G值相对较高,而3'端△G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3'端的△G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发...