扩增结束后可按照质粒抽提试剂盒对质粒进行提取。提取的 Parkin 过表达质粒和阴性对照质粒，进行测序(一般可交由公司完成测序)。将测序结果与目的基因序列进行比对分析，后续进行质粒转染。质粒抽提怎么选？质粒提取的目的是去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA 分开，随后去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。按得...
过表达(Over-Expression,OE)是上调基因表达最常用的方法,其基本原理是将目的基因构建到质粒或病毒载体中,导入细胞内使基因的表达量增加。 使用质粒法过表达外源基因具有简便、成本低和实验体系成熟等优点,因此大多数实验室会偏向于使用质粒法。 今天我们就来聊聊质粒提取那些事儿~ 质粒:一个小型环状双链 DNA 分子,存在于细菌染色体外,
二、质粒构建、转化、扩增、提取及鉴定 1 构建 ▐ 带有 GFP 标记的 Parkin 过表达质粒 2 转化扩增 3 抽提和鉴定 质粒抽提怎么选? 三、质粒转染及观察 1 细胞培养 2 分组 3 转染 四、RT-PCR/Western Blot 检测其表达 1 RT-PCR ▐ 实时荧光定量 PCR(RT-PCR)检测 EGFP-Parkin mRNA 的表达水平 2 Weste...
起始培养体积应基于培养细菌密度,用来提取质粒的细菌的 OD600 建议为 2-3。 2 低拷贝质粒如何增加产率? 在一个细菌细胞中只有 5 个以下的相同质粒时,该质粒是低拷贝质粒;当在一个细菌细胞中可以有几百个相同质粒时则该质粒是高拷贝质粒。若大提质粒或者小提质粒的实验效果不好时,则需要加大提取的菌体量,可进行...
质粒分子小(0.2-10 KD),因此便于分离和提取,可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。 图1. 大肠杆菌质粒分子结构示意图。 接下来,我们以“Parkin基因过表达质粒和细胞模型的构建”为例详细展开[1]! 知识链接: Parkin是帕金森病的遗传易感基因之一,其突变和蛋白功能缺陷可导致 PD。早期的研究...
质粒的构建可经公司购买得到,一般同时提供阴性对照菌液及质粒。 利用限制性内切酶消化获得线性化载体,PCR 扩增制备 Parkin 基因片段,所用扩增引物需在其 5' 端添加同源重组序列,使用该引物扩增基因片段,扩增产物 5' 和 3' 最末端的序列分别与线性化载体两末端序列完全一致。以线性化载体和基因扩增产物配制反应体系,...
构建 ▐带有 GFP 标记的 Parkin 过表达质粒 质粒的构建可经公司购买得到,一般同时提供阴性对照菌液及质粒。 利用限制性内切酶消化获得线性化载体,PCR 扩增制备Parkin基因片段,所用扩增引物需在其 5' 端添加同源重组序列,使用该引物扩增基因片段,扩增产物 5' 和 3' 最末端的序列分别与线性化载体两末端序列完全一致...
扩增结束后可按照质粒抽提试剂盒对质粒进行提取。提取的Parkin过表达质粒和阴性对照质粒，进行测序(一般可...
扩增结束后可按照质粒抽提试剂盒对质粒进行提取。提取的Parkin过表达质粒和阴性对照质粒，进行测序(一般可...
转化是将冻存的BL21感受态融化后插在冰上5-10分钟，然后将5 ul质粒加入感受态细胞，放在冰上20分钟。再将其放在42℃恒温槽热激1-2分钟，然后迅速放回冰中静置3-5分钟。之后将感受态细胞加入500 ul SOC培养基中，放入37℃摇床1 h。之后用接种环在含有质粒对应抗性的平板上划线。长出来的单菌落就是...