质粒：一个小型环状双链 DNA 分子，存在于细菌染色体外，能独立复制并稳定遗传。质粒分子小 (0.2-10 KD)，因此便于分离和提取，可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。图 1. 大肠杆菌质粒分子结构示意图。接下来，我们以“Parkin基因过表达质粒和细胞模型的构建”为例详细展开[1]！知识链接...
质粒:一个小型环状双链 DNA 分子,存在于细菌染色体外,能独立复制并稳定遗传。质粒分子小(0.2-10 KD),因此便于分离和提取,可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。 图1. 大肠杆菌质粒分子结构示意图。 二、质粒构建、转化、扩增、提取及鉴定 接下来,我们以“Parkin基因过表达质粒和细胞模型的...
起始培养体积应基于培养细菌密度,用来提取质粒的细菌的 OD600建议为 2-3。 2 低拷贝质粒如何增加产率? 在一个细菌细胞中只有 5 个以下的相同质粒时,该质粒是低拷贝质粒;当在一个细菌细胞中可以有几百个相同质粒时则该质粒是高拷贝质粒。若大提质粒或者小提质粒的实验效果不好时,则需要加大提取的菌体量,可进行...
起始培养体积应基于培养细菌密度,用来提取质粒的细菌的 OD600 建议为 2-3。 2 低拷贝质粒如何增加产率? 在一个细菌细胞中只有 5 个以下的相同质粒时,该质粒是低拷贝质粒;当在一个细菌细胞中可以有几百个相同质粒时则该质粒是高拷贝质粒。若大提质粒或者小提质粒的实验效果不好时,则需要加大提取的菌体量,可进行...
质粒分子小 (0.2-10 KD),因此便于分离和提取,可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。 图1. 大肠杆菌质粒分子结构示意图。 接下来,我们以“Parkin 基因过表达质粒和细胞模型的构建”为例详细展开[1]! 知识链接: Parkin 是帕金森病的遗传易感基因之一,其突变和蛋白功能缺陷可导致 PD。早期的...
构建 ▐带有 GFP 标记的 Parkin 过表达质粒 质粒的构建可经公司购买得到,一般同时提供阴性对照菌液及质粒。 利用限制性内切酶消化获得线性化载体,PCR 扩增制备Parkin基因片段,所用扩增引物需在其 5' 端添加同源重组序列,使用该引物扩增基因片段,扩增产物 5' 和 3' 最末端的序列分别与线性化载体两末端序列完全一致...
构建 ▐带有 GFP 标记的 Parkin 过表达质粒 质粒的构建可经公司购买得到,一般同时提供阴性对照菌液及质粒。 利用限制性内切酶消化获得线性化载体,PCR 扩增制备Parkin基因片段,所用扩增引物需在其 5' 端添加同源重组序列,使用该引物扩增基因片段,扩增产物 5' 和 3' 最末端的序列分别与线性化载体两末端序列完全一致...
质粒提取最常使用的是碱裂解法。即在强碱性条件下，使质粒 DNA 和基因组 DNA 同时从细胞中释放出来，...
转化是将冻存的BL21感受态融化后插在冰上5-10分钟，然后将5 ul质粒加入感受态细胞，放在这香的规针越...
原因可能是：1、培养时间有点短了，导致菌液浓度较低 2、提取质粒时，损耗的较多，不知道你用的是试剂盒还是碱法，可以再洗脱离心的时候，将弃液转移回去再多离心一次，可以提高回收率；你也可以多提几管，最终合并为一管，提高浓度 只有3、400bp，不知道你指的是全部序列还是你的目的基因序列，你...