在探针法qPCR中，除加入引物外还增加一条特异性探针，当引物和探针都与靶基因结合时，扩增时探针才会被水解酶切发出荧光；当引物发生非特异性扩增时，探针不会结合到非特异性片段上，因此不会被水解酶切而发出荧光，从而提高了特异性。2.准确度和灵敏度高 对于低拷贝或者低浓度样品，相比于染料法，探针法避免了引...
Taqman探针法原理: 在PCR扩增反应加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针(Taqman探针),该探针5’端标记一个荧光染料报告基团(Reporter, R),3’端标记一个淬灭荧光基团(Quencher, Q)。开始时,探针完整地结合在DNA任意一条单链上,报告基团(R)发射的荧光信号被淬灭基团(Q)吸收,检测不到荧光信号;PCR扩增时,Ta...
众所周知,目前主流的实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)方法分为染料法和探针法,染料法以SYBR Green法为代表,SYBR Green染料游离时荧光微弱,但但一旦与双链DNA结合后,荧光大大增强,反应管中的荧光强度与反应管中双链DNA的数量成正比例关系,因此可以通过检测荧光计算反应管中产生的双链DNA(PCR产物)的量...
根据信号基团的不同，qPCR可以分为染料法和探针法。非特异的染料法成本较低，但会出现类似于普通PCR扩增产物干扰的假阳性情况。探针法利用荧光探针实时监测PCR反应过程中的DNA合成情况，定量检测样品中的目标序列，可以很好地解决染料法中存在的非特异性问题。当下，有多种类型的探针可用于qPCR，不同的探针通过使用不同...
荧光定量 PCR(Real-time PCR),是指在 PCR 扩增反应体系中加入荧光基团,通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 以探针法荧光定量 PCR 为例:PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基...
SYBR Green Ⅰ 染料法因具有使用简便,价格便宜等优点而被广泛使用。但其最大的缺点是缺乏特异性,即染料可以与任何dsDNA结合。因此,qPCR反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值,影响定量结果的准确性,而TaqMan探针法的出现很好地解决了染料法非特异性的问题。
一般常规使用的标记方法为缺口平移法和随机引物法，对于人工寡聚核苷酸则采用末端标记法。随着PCR技术的出现，多采用PCR技术，在利用引物扩增核酸探针的同时将探针标记，是一种快捷、方便的标记手段。体内核酸分子的标记是将放射性化合物加入活细胞中，使之在细胞中被利用，从而使生物大分子被标记。
目前,实时荧光定量PCR技术主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,并结合相应的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。 01 一、荧光染料法 在PCR反应体系中,加入过量荧光染料,该染料只与双链DNA小沟结合,...
探针法是在待测量物体上接触两个探头,然后测量两个探头之间的电压和通过两个探头之间的电流。根据伏特定律可以计算出待测物体上的电阻。 具体步骤如下: 1. 准备工作:将待测物体放置在稳定平台上,并将测试仪器接通。 2. 接触探头:将两个探头分别接触待测物体上需要测试的两点。 3. 测试:打开测试仪器,并记录下两...