Transfer plasmid(第二代或第三代) VSV-G:pMD2.G(Addgene #12259) Rev:pRSV-Rev(Addgene #12253) Gag/Pol:pMDLg/pRRE(Addgene #12251) Tat:pCEP4-tat(Addgene #22502) 2、细胞系 低传代数293T细胞 3、试剂 293T培养基:高糖DMEM(含丙酮酸钠、谷氨酰胺)+ 10% FBS + GlutaMAX。 病毒收获培养基:...
Oxford BioMedica在293T细胞表达的EIAV慢病毒的基础上开发了一种稳定包装细胞系和一个Tet-on诱导系统,在该系统中,向培养基中添加多西霉素之后,Tet抑制子(TetR)紧密调控VSV-g和Gag/Pol的表达。该系统与Tet-off系统相比渗漏表达更低。EIAV转移载体编码一个治疗帕金森氏...
但是来源于HIV-1病毒的env蛋白只能识别CD4受体（主要由辅助T（Th）细胞表达，是Th细胞TCR识别抗原的受体），宿主范围受限。后面就优化成使用来源于水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的编码病毒包膜糖蛋白的VSV-G基因代替原病毒的env基因，VSV-G蛋白的受体为低密度脂蛋白(LDL)受体，普遍存在于多种哺乳动物...
包膜质粒，表达更广宿主范围的病毒包膜糖蛋白的VSV-G蛋白。转移质粒，将组成型启动子构建在目的基因上游的LTR序列中，同时删除了部分3' LTR序列，破坏了LTR的启动子/增强子活性，这样病毒插入到基因组后会自我失活（self-inactivating，SIN），从而进一步提高了安全性。删除了部分5' LTR序列，与异源启动子/增强子融合...
第2个质粒:包膜质粒(Envelope Plasmid),含有VSV-G序列(用以替换env序列),编码包膜蛋白。 第3个质粒:转移质粒(Transfer Plasmid),含有病毒的LTRs和Ψ包装信号(图片未画出),除非有内部启动子,否则这个Transfer Plasmid的目的序列是由5'LTR驱动的,它是一个弱启动子,需要Tat元件激活。所有的第2代慢病毒Transfer Plasm...
VSV-g作为应用最广泛的慢病毒异源包膜蛋白,它有很强的细胞毒性。它的表达必须在慢病毒生产时诱导表达来防止包装细胞死亡。此外,HIV的gag和pol基因的表达也有细胞毒性和抑制细胞生长活性,因此这些基因的高表达必须控制在病毒生产阶段。第一个常用的诱导系统是Tet-on和Tet-off系统,它通过向培养基中添加或去除四环素/多...
膜蛋白质粒表达的VSV-G膜蛋白锚定在细胞膜上,随着病毒成熟,与细胞膜一起成为了病毒的膜。细胞短暂孵育后,收集上清,离心去除细胞碎片并过滤。 第4天:PEG浓缩病毒颗粒。对于超纯化慢病毒(体内应用级别),采用蔗糖离心方法进一步纯化、浓缩病毒。 第5天及以后:对病毒进行滴度测定(Titer determination)、微生物检测(...
（1）第一代包装系统 第一代包装系统由3个质粒（穿梭质粒、包膜质粒、包装质粒）组成。穿梭质粒即目的基因表达载体，携带外源目的基因，为降低病毒复制能力，穿梭质粒将5′LTR 换成CMV强启动子，3′LTR 换成 SV 40 polyA 位点；包膜质粒是将env替换成VSV-G，提高病毒的宿主范围；包装质粒由CMV强启动子、编码3种...
pCMV-VSV-G (慢病毒包装用质粒)是慢病毒包装的辅助质粒,也常被称作pCMV-VSVG,主要用于和pCAG-dR8.9质粒(D8216)(或类似用途质粒)及慢病毒载体质粒如pLenti-H1系列(D8202)、pLKO系列等共同转染HEK293细胞等以包装重组慢病毒。 pCMV-VSV-G含有在CMV启动子驱动下表达疱疹性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)的基因序列,...
pCMV-VSV-G是慢病毒包装的辅助质粒,载有病毒VSV-G基因,可以用于**代和第三代慢病毒包装系统。pCMV-VSV-G与pCMV-dR8.9(JY03033)[或者psPAX2(JY03029),两者均为**代慢病毒包装质粒,二者选一即可]及慢病毒载体质粒,构成三质粒系统(即**代慢病毒系统),共同转染293T细胞等即可以包装慢病毒。pCMV-VSV-G也...