实时PCR(RT-PCR)是一种使用荧光染料或探针(实验室通常称为引物)技术对样品中存在的核酸进行定量的技术或实现靶基因/序列的扩增。RT-PCR足以扩增目标或模板DNA (cDNA是其中一种),也就是说,它可以在PCR仪器(热循环仪器)复制DNA。它使我们能够研究目标序列或基因,因此一直是遗传学中的一项关键技术。 (图3 RT-PCR...
1、PCR原理:在解旋酶作用下,打开DNA双链,每条DNA单链作为母链,以4种游离脱氧核苷酸为原料,合成子链,在引物作用下,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物,其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
然后将cDNA用作qPCR或实时PCR反应(qPCR)的模板,RT-qPCR用于多种应用,包括基因表达分析、RNAi验证、微阵列验证、病原体检测、基因检测和疾病研究等,是非常常见和通用的一种生物科学实验技术。 对于qRT-PCR称呼有不同的形式,但总体上来说,实时定量反转录聚合酶链式反应(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR...
End-point RT-PCR 终点RT-PCR 的测量方法需要通过使用荧光染料(如溴化乙锭)、 使用磷光成像仪对 PCR 产物进行P32标记、或通过闪烁计数来检测基因表达水平。终点 RT-PCR 通常使用三种不同的方法实现:相对、竞争和比较。 Relative RT-PCR RT-PCR 的相对定量涉及同时对内部对照与感兴趣的基因进行共扩增。内部控制用于...
国际原子能机构与联合国粮食及农业组织合作帮助各国使用实时逆转录-聚合酶链反应应对病毒。 阅读原文:如何使用实时逆转录-聚合酶链反应检测新冠病毒? | IAEA 随着引起新冠疾病的冠状病毒在全球范围内传播,原子能机构与联合国粮食及农业组织(粮农组织)合作,提供支持和专门知识,帮助各国使用实时逆转录-聚合酶链反...
(1)由图1和图2可知,PCR反应模板为病毒的RNA。图1和图2所示新冠检测基本原理是:将新冠病毒RNA逆转录为DNA,采用多重荧光RT-PCR技术,因此荧光PCR法所用的试剂盒中通常都应该含有:逆转录酶、热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+、缓冲剂系等。(2)由图2可知,引物、TaqMan探针能与模板链结合...
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。 实验步骤: 一、总RNA的提取总RNA提取可以:(1)获得高纯度、高...
请分析回答问题引物、引物RT酶、PCR酶等探针等RNARNADNA(1)构建cDNA文库时,第一步会利用酶),还需要酶)将cDNA断开并与结合,然后把各个片段导入到一个受体菌群中储存。(2)在配置PCR扩增液时,加入的荧光探针序列 5'-TTGCT⋅m⋅⋅⋅⋅AGATT-3' ,如果模板中存在N基因序列,与探针结合的序列应该是5'-(...
新型冠状病毒的检测方法很多,实时荧光RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)法是目前核酸检测的主要方法,操作流程:采集样本→提取RNA→逆转录成cDNA→PCR扩增→结果分析。如图是RT-PCR两步法的过程图,在PCR扩增时加入能与目的基因(新冠病毒的核壳蛋白N基因)结合的荧光探针。目的基因合成越多,荧光信号越强,回答下列问题。(1...