寡核苷酸脱氧胸苷(oligo(dT)),模板3’端的序列有可能被过量拷贝,从而在cDNA中所占比例过大,这取决于反转录酶的质量及反应条件。随机序列的寡核苷酸,旨在使用序列极为多样的一个寡核苷酸集群,以期至少有一些寡核苷酸与模板退火并作为反转录的引物;特定序列的寡核苷酸,作为合成与某一段特定的mRNA相对应的cDNA的引物。
❖ DNA聚合:在此步骤中,反应温度和持续时间可能会根据所使用的引物和反转录酶而变化。使用oligo (dT)引物(Tm〜35-50 ℃),可以在反转录酶的最佳反应温度(37-50 ℃)下直接孵育反应。随机六聚体引物因其较短的长度,通常具有较低的Tm(〜10-15℃)。因此,当使用随机六聚...
例(1)尽管流感病毒基因组中不含有polyA尾,但其感染细胞后,能够在细胞内获得5'帽子和3'polyA尾,因此从流感病毒感染的细胞中扩增基因反转录,可以用oligo (dT) 引物,这时模版其实是病毒的mRNA,而不是vRNA。 因为流感病毒的每个基因节段都含有长度不等的末端重复区(UTR),因此也可以用其基因3'端的一个保守的12nt...
反转录过程中可用作复制引物的是 A. 病毒自身的mRNA B. 病毒自身的tRNA C. 病毒自身的rRNA D. 宿主细胞的tRNA
在进行RNA反转录后，如果目标基因扩增出条带而内参基因没有扩增出来，可能的原因有多种。首先，内参引物可能存在质量问题，如引物序列错误或引物质量不佳，这可能导致内参基因无法有效扩增。其次，PCR扩增内参基因时的条件设置可能存在问题，比如退火温度（Tm）不合适，过高或过低的退火温度都会影响扩增效率，...
可以是相同的引物。RT-PCR中的One-step PCR就是在反转录cDNA和 PCR 扩增一步完成，使用的就是你说的...
这可能是由于PCR产物的污染或PCR反应体系中存在杂质所致。综上所述，反转录cDNA第一链未得到预期产物以及PCR扩增仅产生引物二聚体的问题，可能是由RNA质量不佳、反转录酶选择不当、PCR反应条件不适宜等多种因素导致的。通过仔细检查和优化实验条件，可以有效解决这些问题。
1.一种具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列,用于设计miRNA qPCR检测所用的正向引物。 2.一种具有SEQ ID NO:2的通用反向引物,用于在miRNA qPCR检测中进行cDNA分子扩增。 3.根据权利要求2所述的具有SEQ ID NO:2的通用反向引物,其中所述通用反向引物的Tm值为59.1℃。 4.一种通用反转录引物,用于对待测miRNA进行cDNA合...
01 反转录 反转录实验原理: 根据不同的情况选择不同的反转录引物: (1)RNA 有 polyA 尾:用Oligo(dT)要求作为反引物,要求RNA 质量好,否则poly(A) 尾可能降解,造成全长 cDNA 合成量大大降低。 (2)RNA 没有 polyA 尾:如原核生物 RNA、真核生物的 rRNA、tRNA,用随机引物 (Random primer)作为逆转录引物。