平末端：在基因克隆中，平末端通常是在限制性核酸内切酶识别位点处切割获得的。这种情况下，限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线处切开，产生的就是平末端。这种末端结构在自然界中很少出现，但在一些实验室技术中会使用。例如，在一些特殊情况下，例如进行基因敲除或同源重组等实验中，平末端可能会更有效。粘性末端：...
通过在实验前后比较克隆形成率,研究人员可以评估潜在药物或治疗方案的疗效。 常用的手段有两个: ①平板克隆形成实验:通过将细胞培养于培养基中,主要适用于贴壁生长的细胞,以评估细胞的克隆形成能力。 ②软琼脂克隆形成实验:通过将细胞悬浮于含琼脂糖的培养基中,主要用于评估贴壁和悬浮的肿瘤细胞或转化细胞系的克隆形成...
根据细胞生长方式的不同,克隆形成的培养介质分为两类,即平板克隆和软琼脂克隆。 1. 平板克隆形成实验:适用于贴壁生长的细胞,操作相对简单,细胞间可自由接触,利于形成克隆。 2. 软琼脂克隆形成实验:适用于悬浮生长的细胞,将细胞悬液与软琼脂混合,利用软琼脂为培养介质,形成克隆。 图3 软琼脂克隆形成制备过程(源于...
受限于酶切位点:传统分子克隆是;无缝克隆不是。 引入多余序列:传统分子克隆是;无缝克隆不是。 流程&操作时间:传统分子克隆流程繁琐,时间长。 无缝克隆流程简单,时间短。 克隆效率:传统分子克隆较低;无缝克隆单片段≥95%。 实验流程 1.载体制备 载体的线性化:酶切(单酶切、双酶切)或反向 PCR 扩增。
克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法。所谓克隆是指单个细胞在体外持续增殖6代以上其后所形成的细胞群,形成肉眼可见的克隆。通过计数得出克隆形成率,克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 克隆形成的目的 1)通过对细胞处理后在细胞培养板上的克隆形成能力来提示处理后细胞的增殖能力。
无论实验目的是什么,最常见的两种亚克隆方法始终是限制性酶切和PCR 克隆技术。 在这两种方法中,通过限制性酶切消化进行亚克隆较为传统。该实验流程利用两种限制性内切酶对载体和插入片段进行双重消化,生成粘性末端(图 2)。由于载体和插入片段只能沿...
受限于酶切位点:传统分子克隆是;无缝克隆不是。 引入多余序列:传统分子克隆是;无缝克隆不是。 流程&操作时间:传统分子克隆流程繁琐,时间长。 无缝克隆流程简单,时间短。 克隆效率:传统分子克隆较低;无缝克隆单片段≥95%。 实验流程 1.载体制备 载体的线性化:酶...
☆ 实验步骤 在分子克隆中,载体选择是非常关键的一步,因为它的性质和种类将直接影响实验的效率和结果。根据载体的性质和功能,可以将其分为以下几类: 按进入受体细胞的类型分类: 原核载体:原核细胞(如大肠杆菌)可直接摄取并表达重组体中的外源基因,因此原核载体常被用于原核细胞克...
Figure 1. 传统分子克隆实验流程 载体制备 传统分子克隆方法所用的载体基于质粒,而后者为不依赖基因组 DNA 在细菌内复制的双链游离 DNA。所有基于质粒的克隆载体包含许多关键要素,包括:确保在细菌宿主细胞内能有效增殖的复制原;单一酶切位点,或更常...