蛋白酶和磷酸酶抑制剂▼▼ 内源性和外源性的蛋白酶会在细胞或组织裂解后迅速降解蛋白。 在细胞裂解的步骤加入蛋白酶抑制剂混合物可确保蛋白免于降解,磷酸酶抑制剂可以保持蛋白的磷酸化状态。 蛋白酶和磷酸酶的成分组成(了解一下就行)▼▼ 获得高质量的裂解物▼▼ 根据情况,结合超声、匀浆等物理方法,配合去垢剂裂解。
▐ 1. 制胶(使用预制胶板请忽略此步骤) (1) 准备玻璃板,确保两块玻璃板下缘水平且均无豁口,安装时内长外短,用手压实玻璃板及垂直槽制胶架。 (2) 倾斜垂直槽制胶架子装入垂直槽制胶固定架,注意为防止胶片变形漏液体,不要过分用力下压,并确保卡好。(3) 按照每块 5 mL 配制分离胶 (1 mm 厚度),轻...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
四、主要步骤 五、 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似,但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG分离的蛋白质样品,转移到固相载体 (例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
蛋白质印迹法(Western blot)又称免疫印迹法,是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺凝胶电泳按相对分子 质量大小分离,再转移到杂交膜上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。其主要 步骤:①蛋白样品的制备;②将经过SDS -PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄 膜)上;固相载体以非共价键形式...
WesternBlot操作步骤 1.样品处理: -收集样品:从细胞培养物中收集细胞或从组织中收集组织样品。 -破碎细胞:使用合适的细胞破碎缓冲液将细胞破碎并释放蛋白质。 -甲醇沉淀:向破碎细胞中加入冷甲醇,以沉淀蛋白质,并将混合液冷冻在-20℃或-80℃下,使形成沉淀物。 -洗涤:使用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀物,去除甲醇等杂质。
Western blot 步骤 1、配制裂解液 1mlRIPA+10ul蛋白酶抑制剂+ 10ul磷酸化酶抑制剂(100:1:1比例,需要多少配多少就配多少裂解液) 2、将培养瓶中的细胞用4℃冰冻的 PBS 液冲洗两遍 (冰冻的PBS液是为了保持细胞的活力) 3、加入裂解液(六孔板每孔加60-80uRIPA)冰上裂解30min,之后刮取细胞,培养瓶 100ul/...
Western，也叫 Western blot, Western blot blot, Western印迹法，是检测蛋白质抗体的重要方法之一。运作步骤：1.用块称量。2.用液氮，将组织块粉碎。3.加入 RIPA缓冲剂(每克组织3 ml RIPA)、 PMSF (每克组织30μ l,10 mg/ml PMSF)，继续保持4℃的 Polytron (每克组织3 ml RIPA)。4. PMSF (每克组织...
1.准备一张适合大小的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)以及滤纸6片。将胶浸泡于转移缓冲液中10min(如检测小分子蛋白,即可免去这一步骤,因小分子蛋白容易扩散出胶)。 2.在使用PVDF膜之前需进行活化:PVDF膜需在纯甲醇中浸泡3-5s,再于盆里加入转移缓冲液,并把转膜用的架子、玻璃棒、滤纸、两块海绵和经过甲醇活化的PVDF活化...