蛋白酶和磷酸酶抑制剂▼▼ 内源性和外源性的蛋白酶会在细胞或组织裂解后迅速降解蛋白。 在细胞裂解的步骤加入蛋白酶抑制剂混合物可确保蛋白免于降解,磷酸酶抑制剂可以保持蛋白的磷酸化状态。 蛋白酶和磷酸酶的成分组成(了解一下就行)▼▼ 获得高质量的裂解物▼▼ 根据情况,结合超声、匀浆等物理方法,配合去垢剂裂解。
吸显影液滴在膜上,确保显影液浸润到了膜所有地方;3、image Lab曝光步骤:膜放置皿中(小口径玻璃皿中)—打开仪器(image lab),膜放入机器—选择印迹—colorimetic—自动曝光—拍白光圈4、曝光拍照(CHEMI)—选择“放置凝胶”——设置曝光时间(自动or手动)—凝胶成像—保存注意:一抗原液(1:1000)稀释,若显影条带...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
蛋白质印迹法(Western blot)又称免疫印迹法,是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺凝胶电泳按相对分子 质量大小分离,再转移到杂交膜上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。其主要 步骤:①蛋白样品的制备;②将经过SDS -PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄 膜)上;固相载体以非共价键形式...
WesternBlot操作步骤 1.样品处理: -收集样品:从细胞培养物中收集细胞或从组织中收集组织样品。 -破碎细胞:使用合适的细胞破碎缓冲液将细胞破碎并释放蛋白质。 -甲醇沉淀:向破碎细胞中加入冷甲醇,以沉淀蛋白质,并将混合液冷冻在-20℃或-80℃下,使形成沉淀物。 -洗涤:使用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀物,去除甲醇等杂质。
Western blot法的方法包括以下步骤: 1.蛋白质电泳分离:将待检测的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳分离。SDS-PAGE可以将蛋白质按照大小分离,同时使用SDS可以使蛋白质带有负电荷,使其移动速度更加均匀。 2.转移:将蛋白质从凝胶转移到聚乙烯膜(PVDF)或硝酸纤维素膜(NC)上。转移可以使用湿法或半湿法...
Western blot 步骤 1、配制裂解液 1mlRIPA+10ul蛋白酶抑制剂+ 10ul磷酸化酶抑制剂(100:1:1比例,需要多少配多少就配多少裂解液) 2、将培养瓶中的细胞用4℃冰冻的 PBS 液冲洗两遍 (冰冻的PBS液是为了保持细胞的活力) 3、加入裂解液(六孔板每孔加60-80uRIPA)冰上裂解30min,之后刮取细胞,培养瓶 100ul/...
1.准备一张适合大小的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)以及滤纸6片。将胶浸泡于转移缓冲液中10min(如检测小分子蛋白,即可免去这一步骤,因小分子蛋白容易扩散出胶)。 2.在使用PVDF膜之前需进行活化:PVDF膜需在纯甲醇中浸泡3-5s,再于盆里加入转移缓冲液,并把转膜用的架子、玻璃棒、滤纸、两块海绵和经过甲醇活化的PVDF活化...