一般情况的蛋白上样量调整不大,我所做实验常规蛋白上样量为5-8μg之间(15孔梳子),但对于比较难显影的磷酸化蛋白,上样量可提高至40-45μg之间。 图3 4.保证发光液覆盖全膜。如图3B所示,从左往右第二个条带显影不均匀,左侧少一块,在其他三个条带均正常的情况下,应考虑为发光液覆盖不均匀,这种情况可再加...
将电泳槽放于电泳盒中，双手分别捏住梳子轻轻拔出，检查胶口是否被胶堵住，如果正常便向电泳槽加电泳液至溢出为止。根据样本数量，吸取3ul marker于胶板口（建议样本两侧都加3ul，防止边缘效应），并依次加入适量上样液（注：上样时需缓慢注入，样本第一次上样推荐10ul，副口，方便后期调整内参）。然后向电泳槽...
一般情况的蛋白上样量调整不大,我所做实验常规蛋白上样量为5-8μg之间(15孔梳子),但对于比较难显影的磷酸化蛋白,上样量可提高至40-45μg之间。 图3 4.保证发光液覆盖全膜。如图3B所示,从左往右第二个条带显影不均匀,左侧少一块,在其他三个条带均正常的情况下,应考虑为发光液覆盖不均匀,这种情况可再加...
上层胶:AB液:1:1配置(1.0玻璃板两板:2ml:2ml);促凝剂:40ul;灌入后,根据样本数量不同选择不同梳子类型(推荐:15口梳子,内参更易齐哦!!!);时间:30分钟以上 ② 电泳 将制好的胶板取出,安装于电泳槽上(注:小玻璃板在内侧,如只制作一板胶,则需将假板放于一侧,防止电泳液泄露)。将电泳槽放于电泳盒中,双...
3. 轻轻拔出梳子,样品置冰上防降解,用20μl的枪头吸取样品插入加样孔中缓慢加样,第一孔和最后一孔加marker3u和5u,中间加样品,长时间放置的样品需要离心后再用,加样前吹打混匀;通常总的上样量为20ug/孔,总体积不能超过 30ul。 4.电泳:电泳电压80V跑到铁丝下面,1.5h左右 ...
对于10孔梳子1mm厚度凝胶,每孔上样量(蛋白质混合物)约30ug。二:聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(电泳) 将电极插头与电源上对应的电极连接,电流应流向正极; 将电压调至80V,预计20min后待染料迁移至分离胶时,将电压调至100V,60min待溴酚蓝到达凝胶底部时,停止电泳,关闭电源,从电源上拔掉电极插头,从平板中...
Western Blot间接法基本原理:首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离,然后转移到固相载体(例如PVDF膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的PVDF膜就称为一个印迹(blot),用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液(如5%的BSA或脱脂奶粉溶液)处理以封闭PVDF...
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 一、实验材料与方法 1、主要试剂 2、主要仪器 3、实验方法 3.1、上样准备 (1)按照BCA蛋白定量试剂盒说明书测定蛋白浓度,确定蛋白上样量。
蛋白质免疫印迹法即Western Blot。 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜(NC膜)或PVDF膜上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。