虽然Smart-seq技术也迭代了多个版本,但是迄今为止,Smart-Seq2是使用最多且被广泛认为更稳定的技术类型,也是国内市场众多科技服务公司推崇的技术之一。 3.1、Smart-seq2技术原理 Smart-seq2关键技术原理有: 01、MMLVRT 使用的MMLV具有链置换活性和末端转移酶活性。其在逆转录到达mRNA 5’端末端时,会在新合成的cDNA的...
在本技术中,最核心的原理在于首先使用了莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶(MMLVRT),该逆转录酶不仅具有逆转录活性,还具有模板转换以及末端转移酶的活性,能在反转录的过程中往新合成的cDNA的3’末端添加几个胞嘧啶。其次,在于模板置换的过程中使用了独特的模板转换寡核苷酸(TSO)作为模板转换的靶点。上述两大核心原理使Smar...
总之,RNA-seq允许在正常和处理过程中对转录组进行高通量的检测,揭示样品间整体转录组水平的动态变化。 本文将简单介绍RNA-Seq建库策略--Smart-seq2的基本原理 smart-seq2流程.png 1.收集细胞 将细胞处理后(胚胎需去除透明带),置于含有RNA酶抑制剂的细胞裂解中,如果不立即进行实验需置于-80℃保存。(细胞处理过程尽...
Smart-seq因为以全长mRNA建库,所以对转录本的测序覆盖度也有所上升。Smart-seq2是由Picelli等人从Smart-seq中改良而来(Picelli et al., 2013)(Picelli et al., 2014)。本文将从Smart-seq2的原理、优点和缺点来为大家介绍这项scRNA-seq技术。 Smart-seq2建库原理 Smart-seq2的建库原理如下: 单细胞分选:Smart-...
技术原理 SMART-seq(Switching mechanism at 5’ end of the RNAtranscript)是由美国和瑞典科学家于2012年共同开发的一种单细胞转录组测序技术,其能够检测mRNA 的全长,从而实现了转录本异构分析分析和 SNV 检测。2013年,Nature Methods 杂志上报道了 SMART-seq2,该技术是经 SMART-seq 改进的一种测序方法,也是目前...
核心原理在于利用Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase（MMLV-RT）的神奇特性。首先，MMLV-RT在合成cDNA过程中，会在3'端随机引入几个不依赖模板的碱基，如常以胞嘧啶为主，这个看似多余的小动作，实则是科学家们获取完整转录本信息的关键。通过设计模板切换 oligo（TSO），MMLV-RT能灵活地从...
Smart-seq2的核心原理包括使用莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶（MMLVRT）进行高效反转录合成cDNA，以及使用模板转换寡核苷酸（TSO）进行模板置换。这些原理确保了更高的覆盖率和精度。基本实验流程涉及单细胞分选、反转录、模板置换、cDNA扩增、文库构建、上机测序及生信分析。在应用领域方面，Smart-seq2技术已应用...
Smart-seq2原理:通过设计oligo(dT)VN Primer作为逆转录引物,利用MMLVRT的模板转换活性,在cDNA的3’端添加一段接头序列,通过该接头序列进行反转录,生成cDNA第一条链。当逆转录酶到达mRNA5’末端时,会连续在末端添加几个胞嘧啶(C)残基。然后添加TSO(template-switching oligo)引物,退火后结合在第一条链的3’端与po...
Smart-Seq2建库原理 1. 单细胞分选:Smart-seq2使用流式细胞仪或显微操作进行细胞分选,体积不超过0.5 ul。 2. 细胞裂解:将分离细胞直接转移到细胞裂解液中进行细胞裂解。 3. 反转录( 一链合成 ):使用Oligo(dT) primer 对带有polyA尾的RNA( 主要mRNA )进行反转录。由于使用了特殊活性反转录酶( Moloney Murine...
Smart-Seq2建库原理 1. 单细胞分选:Smart-seq2使用流式细胞仪或显微操作进行细胞分选,体积不超过0.5 ul。 2. 细胞裂解:将分离细胞直接转移到细胞裂解液中进行细胞裂解。 3. 反转录( 一链合成 ):使用Oligo(dT) primer 对带有polyA尾的...