单细胞转录组测序技术,现在常用的是Smart-seq2技术流程和10×Genomics技术流程,两种技术各有优缺点,Smart-seq2技术可以获得完整mRNA的信息,但借助FACS分选一次只能构建96-384个单细胞测序文库;10×Genomics技术可以构建海量的单细胞测序文库(100000级别),但是只能获取mRNA3’端的信息,即只能获取转录本的部分信息。 本章...
对至少 65 个单细胞分析中发现,13361 个基因在 25% 的细胞中至少被一种方法检测到表达,那么挑选这些基因进行分析,MARS-seq 具有最高的 drop out 中位概率(74%),而 Smart-seq2 最低(26%),此时说明 Smart-seq2 具有更好的敏感度,这与之前的敏感度也是对应的。
Smart-seq2建库技术流程图 三、技术优势 (1)模板起始量低:1-1000个细胞或10pg-10ng total RNA即可作为起始模板,进行高效扩增; (2)转录本覆盖度高:通过双端引物扩增全长cDNA,获得全转录组信息,避免3端和5端偏好性,产物完整性好; (3)检测灵敏度高:大幅度增加了低表达基因的检出量 (4)碱基分辨率高:可达单碱...
采用Smart-seq2进行单细胞转录组扩增建库;Illumina HiSeq 2000 3M reads /样本进行测序分析。采用PCA(主成分分析)和t-SNE对ILC中847个表达的基因进行分型分析,将细胞分为4类:ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。应用SCDE软件包对4类细胞的差异基因进行分析,找出共有及特有差异基因,结果发现,CD127+ILCs中共有的差异基...
1.单样本流程 2.多样本流程 后续的分析培训教程可以参考之前的文章:scRNA-seq单细胞分析培训资源汇总,软件方法可以参考:单细胞资源大汇总。 参考资料: 1.https://data.humancellatlas.org/pipelines/smart-seq2-workflow 2.https://learn.gencore.bio.nyu.edu/single-cell-rnaseq/ ...
为了研究卵巢发育过程中体细胞谱系特征,作者结合Fluidigm C1分选和smartseq2建库,在Tg(Nr5a1-GFP)转基因小鼠性腺分化的6个时期(E10.5, E11.5, E12.5, E13.5, E16.5, and post-natalday6)提取了663个细胞(GSE119766),然后使用Hiseq2000 进行双端100bp测序,每个细胞测10M reads。
Smart-seq2建库原理 Smart-seq2的建库原理如下: 单细胞分选:Smart-seq使用流式细胞仪进行细胞分选,一次最大分选细胞通量为96个。 Fluorescence Activated Cell Ssorting 细胞裂解:在细胞裂解液中进行细胞裂解。 反转录( 一链合成 ):使用Oligo(dT) primer对带有polyA尾的RNA(主要是mRNA)进行反转录。由于使用了鼠源...
Smart-seq2的核心原理包括使用莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶（MMLVRT）进行高效反转录合成cDNA，以及使用模板转换寡核苷酸（TSO）进行模板置换。这些原理确保了更高的覆盖率和精度。基本实验流程涉及单细胞分选、反转录、模板置换、cDNA扩增、文库构建、上机测序及生信分析。在应用领域方面，Smart-seq2技术已应用...
Smart-seq2基本流程包括单细胞分选与裂解、反转录、模板置换、PCR扩增、文库构建与测序，最后进行生信分析。Smart-seq2对RNA质量要求高，仅适合真核生物。案例解析显示Smart-seq2在癌症成纤维细胞、植物减数分裂、单细胞RNA-seq等研究中具有广泛应用，为临床医学与生物科学研究提供了重要数据。
Smart-seq2的基本实验流程包括单细胞分选、反转录(第一链合成)、模板置换(第二链合成)、cDNA扩增、文库构建、上机测序以及生信分析的过程。 图2 Smart-seq2的基本实验流程 具体而言,先使用流式细胞仪或者显微切割等方法获取单细胞并置于微孔板中,然后进行细胞裂解。随后在裂解液中加入含有oligo(dT)的引物反转录合成...