而单细胞测序技术能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息,从而很好的解决了这一问题。 二、单细胞技术类型 单细胞技术类型很多,有单细胞转录组、单细胞基因组、单细胞表观组(单细胞ATAC、单细胞CUT&Tag、单细胞甲基化、单细胞Hi-C等)、单细胞蛋白组、单细胞代谢组等,各种技术不断迭代,检测灵敏度也不断提升。
Smart-seq2技术于2013年公布,在单细胞水平对带poly(A)尾巴的RNA分子(主要为mRNA)进行转录组全长扩增及高通量测序的一种高端技术,具体方法采用改进的Smart-seq2技术,能够满足高灵敏度、低偏好性的cDNA扩增,对转录本的整体覆盖情况进行了完善,实现了高水平的序列模板转换。在分析不同细胞间差异表达之外,还能深入检测...
Smart-seq2 单细胞转录组测序通过 SMART 扩增技术对单个细胞中的 mRNA 进行逆转录和 PCR 扩增,结合转座酶建库技术,最终使用高通量测序手段,对单细胞中 mRNA 进行基因表达定量、功能富集、代谢通路等分析。它可以解决传统 RNA 定量技术在早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的...
采用抽样的饱和度分析对测序深度进行评估,当测序深度达到 100 万reads时,这六种测序方法均可达到饱和,但明显 Smart-seq2 具有更好的基因检测效率。 单个细胞进行实验时的敏感度对比 图.不同单细胞技术基因检出情况对比 在相同的单个细胞进行单细胞建库,相同的测序深度下,检测单细胞中基因表达数量。结果发现,Smart-se...
Smart-seq2的基本实验流程包括单细胞分选、反转录(第一链合成)、模板置换(第二链合成)、cDNA扩增、文库构建、上机测序以及生信分析的过程。 图2 Smart-seq2的基本实验流程 具体而言,先使用流式细胞仪或者显微切割等方法获取单细胞并置于微孔板中,然后进行细胞裂解。随后在裂解液中加入含有oligo(dT)的引物反转录合成...
采用Smart-seq2进行单细胞转录组扩增建库;Illumina HiSeq 2000 3M reads /样本进行测序分析。采用PCA(主成分分析)和t-SNE对ILC中847个表达的基因进行分型分析,将细胞分为4类:ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。应用SCDE软件包对4类细胞的差异基因进行分析,找出共有及特有差异基因,结果发现,CD127+ILCs中共有的差异...
时下火热的10X Genomics公司Chromium解决方案无法满足某些特殊或者少量细胞样本甚至单细胞转录组研究。Smart-seq2技术在单细胞水平对带Poly(A)的RNA进行全长转录组扩增及高通量测序,能够满足高灵敏度、低偏好性的cDNA扩增,得到全长转录本,实现高...
单细胞转录组测序技术,现在常用的是Smart-seq2技术流程和10×Genomics技术流程,两种技术各有优缺点,Smart-seq2技术可以获得完整mRNA的信息,但借助FACS分选一次只能构建96-384个单细胞测序文库;10×Genomics技术可以构建海量的单细胞测序文库(100000级别),但是只能获取mRNA3’端的信息,即只能获取转录本的部分信息。
采用Smart-seq2进行单细胞转录组扩增建库;Illumina HiSeq 2000 3M reads /样本进行测序分析。采用PCA(主成分分析)和t-SNE对ILC中847个表达的基因进行分型分析,将细胞分为4类:ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。应用SCDE软件包对4类细胞的差异基因进行分析,找出共有及特有差异基因,结果发现,CD127+ILCs中共有的差异...
7. PCR富集及上机测序:在进行最后一次PCR扩增后,即可上机测序。 10X Genomics单细胞技术 ChromiumTMSingle Cell 3' Solution是基于10X Genomics平台,能够一次性分离、并标记5000–10000个单细胞,并能在单细胞水平进行检测的技术。该方法基于微流控技术(Microfluidics-based approaches),与Smart有相似的分子生物学原理,运...