(A) 用50 μLOpti-MEM稀释1.25μLsiRNA储存液（20μM），轻轻吹吸3-5次混匀，此为V2。(B) 用50μL Opti-MEM稀释1.0μLLipofectamine™2000（使用前轻轻摇匀），轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min，此为V3。(C) 混合转染试剂V3和siRNA稀释液V2，轻轻吹吸3~5次混匀，室温下静置20min。(D) 转...
1、稀释质粒(siRNA)(可在第一天做) (1)从100μM(保存浓度,-20℃)稀释到10μM(工作浓度)=10pmol/μl (2)或1OD粉末溶解于125μlDEPC水中 2、配管(小EP管,小枪头) A+B混合室温静置20min 3、细胞用PBS洗1遍,之后加入0.8ml 完全培养基 4、将2加入3,放入培养箱培养24h更换完全培养基 5、48h后收RNA...
(B) 用50μL Opti-MEM稀释1.0μLLipofectamine™2000(使用前轻轻摇匀),轻轻吹吸3-5次混匀,室温下静置5min,此为V3。 (C) 混合转染试剂V3和siRNA稀释液V2,轻轻吹吸3~5次混匀,室温下静置20min。 (D) 转染复合物(V2+V3)加入到含有细胞及培养液(V1,约400μL)的24孔细胞板中,100 μL/孔,前后轻揺...
125ul。siRNA是一种小RNA分子，一般由Dicer核酸酶加工而成。1odsirna需要加125ul的depc水，溶解之后正好是20um的浓度。
表1, 20 μM储存液的配置方法 siRNA(nmol) 2.5 5 10 50 溶解体积 (μL) 125 250 500 2500 注: 1 OD=2.5 nmol=40 μg,此配置体系仅作为参考,实际配置请按照COA文件进行。 | 对照组的设立 表2, 对照组说明 正式实验为实验组、NC组(*必做)和FAM-NC组(*必做),实验组的抑制效果均需与NC 组比较。
siRNA浓度和用量的一般换算:1OD≈33ug≈2.5nmol 1OD加125ul的水,得到20uM的浓度。1ul就是20pmol,在1ml细胞培养液中加1ul(20pmol),那终浓度就是20pmol/ml=20nM。加2ul就是40nM,以此类推。如果按ug计算,1OD加125ug水溶解后,质量浓度为33ug/125ul=0.264ug/ul。
二,使用荧光标记的siRNA检测转染效率 荧光标记的siRNA的溶解及保存 1.由于OligoRNA是很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,所以打开离心 管前先离心,10000 rpm,2 min然后再慢慢打开管盖,溶解时加适量DEPC水后 盖上管盖,振荡溶解. 2.需要浓度20μM的样品,如何计算重悬siRNA缓冲液的量? 1 OD的siRNA,加入...
2.第二天,待细胞密度达到30-50%时,更换Opti-MEM培养基,转染孔,每孔750uL,非转染孔,每孔1mL,接着进行转染操作: (1)取出质粒DNA/siRNA,短暂离心,1OD的质粒siRNA加入125uL的DEPC H2O重悬,室温静置5min,轻轻混匀离心,溶解后浓度为:20uM,备用。
1 FAM-siRNA的溶解及保存 1.1 由于OligoRNA很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,所以打开离心管前先离心,然后再慢慢打开管盖,溶解时加适量DEPC水后盖上管盖,振荡溶解。 1.2 需要浓度20uM的样品,如何计算重悬siRNA缓冲液的量?你购买了1OD的siRNA,想溶解为20uM 的样品,应该使用125ul附送的DEPC水去重悬1OD...
1OD siRNA≈2.5nM,加入 125ul RNase-free water,即可将 1OD siRNA 配置成 20uM 工作浓度.(由于实验材料,条件及目的不同,此浓度仅供参考) 单链的 miRNA inhibitor 1OD ≈ 5nM, 加入 250ul RNase-free water, 即可将 1OD inhibitor 配置成 20uM 工作浓度. 转染 转染前准备: 转染使用细胞生长密度应根据...