1、CRISPRko敲除文库 通过sgRNA特异性识别靶序列，引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游3 位核苷酸外侧进行切割，造成靶位点DNA双链断裂，由非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制引入移码突变实现敲除。2、CRISPRa激活文库 通过连接dCas9蛋白与转录激活因子VP64实现Cas9蛋白与激活辅助蛋白共表达，完成全基因水平的上调表达。3...
sgRNA文库按照作用效果可以分为CRISPRko敲除文库、CRISPRa激活文库和CRISPRi干扰文库。 1、CRISPRko敲除文库 通过sgRNA特异性识别靶序列,引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游3 位核苷酸外侧进行切割,造成靶位点DNA双链断裂,由非同源末端连接(NHEJ)DNA修复机制引入移码突变实现敲除。 2、CRISPRa激活文库 通过连接dCas9蛋白...
常用的筛选技术包括CRISPR敲除筛选，激活筛选，抑制筛选。高通量sgRNA文库筛选流程 CRISPR敲除筛选 在CRISPR-Cas9的作用下通过NHEJ或HDR进行全基因组不可逆基因消融，然后筛选由此产生的表型改变。CRISPR激活筛选 通过CRISPR-dCas9在不扰乱基因组序列的情况下进行全基因组可逆基因激活，通常采用额外的调控域，然后筛选由此产生...
1)基因敲除文库(CRISPR KO):利用野生型Cas9或Cas9缺刻酶(Cas9 nickase,nCas9)切割DNA,当细胞自身发生随机修复时,可在靶位点(通常是编码区域)引入随机突变,主要用于编码基因的功能筛选。 2)基因激活文库(CRISPRa):转录激活功能域融合无催化活性的Cas9(dCas9),以激活靶位点(通常是启动子区和其他非编码调控区)调节基...
1)基因敲除文库(CRISPR KO):利用野生型Cas9或Cas9缺刻酶(Cas9 nickase,nCas9)切割DNA,当细胞自身发生随机修复时,可在靶位点(通常是编码区域)引入随机突变,主要用于编码基因的功能筛选。 2)基因激活文库(CRISPRa):转录激活功能域融合无催化活性的Cas9(dCas9),以激活靶位点(通常是启动子区和其他非编码调控区)调节基...
高通量sgRNA文库筛选流程 CRISPR敲除筛选 在CRISPR-Cas9的作用下通过NHEJ或HDR进行全基因组不可逆基因消融,然后筛选由此产生的表型改变。 CRISPR激活筛选 通过CRISPR-dCas9在不扰乱基因组序列的情况下进行全基因组可逆基因激活,通常采用额外的调控域,然后筛选由此产生的表型改变。
高通量sgRNA文库筛选流程 CRISPR敲除筛选 在CRISPR-Cas9的作用下通过NHEJ或HDR进行全基因组不可逆基因消融,然后筛选由此产生的表型改变。 CRISPR激活筛选 通过CRISPR-dCas9在不扰乱基因组序列的情况下进行全基因组可逆基因激活,通常采用额外的调控域,然后筛选由此产生的表型改变。
高通量sgRNA文库筛选流程 CRISPR敲除筛选 在CRISPR-Cas9的作用下通过NHEJ或HDR进行全基因组不可逆基因消融,然后筛选由此产生的表型改变。 CRISPR激活筛选 通过CRISPR-dCas9在不扰乱基因组序列的情况下进行全基因组可逆基因激活,通常采用额外的调控域,然后筛选由此产生的表型改变。
为总结规律,研究者对中低活性的错配式sgRNA按照错配位点的特性进行分析,发现错配位点对dCas9蛋白结合能力的影响与错配式sgRNA的活性最为相关,这表明错配式sgRNA的活性主要由普遍的生物物理学规则所决定 除了在靶位点中引入错配突变调节sgRNA活...
sgRNA(单链导向RNA)作为CRISPR/Cas9系统的重要组成部分,其设计直接关系到基因编辑的准确性和效率。然而,由于脱靶效应的存在,sgRNA的设计过程中需进行精确的评估和优化。本文将探讨CRISPR/Cas9系统中sgRNA的设计原则及脱靶效应的评估方法。 二、sgRNA的设计原则 1.靶点选择:选择合适的基因靶点是sgRNA设计的第一步。通常,...