Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法,由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。杂交技术主要有NC膜封闭,靶蛋白与第一抗体的反应,结合靶蛋白的一抗和二抗的反应,显色等组成。将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上,用其他蛋白作为封闭液,将膜上余下的其他蛋白结合位点封闭,加入与检测蛋白特异性的第...
染色的凝胶用水漂洗数遍,沥干水后置于染色皿中,再加入100 ml脱色液,加盖,脱色至染色的凝胶经脱色后能清晰显示出蛋白条带止。
SDS-PAGE检测蛋白表达(protein expression) 一、材料与仪器 30%丙烯酰胺溶液;1.5mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液,PH8.8;1.0mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液,PH6.8;电泳缓冲液,PH8.3;10%SDS溶液;10%过硫酸铵溶液;样品处理液;染色液;脱色液;电泳玻璃板,电泳电源架,电泳槽, 一、材料与仪器 30%丙烯酰胺溶液;1.5mol/L...
对于诱导表达后的菌液来说,OD值一般都会大于2.0,直接菌液离心重悬煮样上SDS,就会出现挂孔现象,挂空滤百分百,在加样的时候也会看出来,样本是一小坨掉入孔底,而不是很顺滑的流入孔底。其次,煮后的样本没离心,也会出现挂空现象,这个挂空几率就得看你的蛋白浓度。 解决办法:5X或者10X稀释重悬后的菌液,然后正常...
免疫印迹,SDS-PAGE,蛋白定量 三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器 材料 1.5mlEP管(康宁生命科学有限公司);15mlEP管(康宁生命科学有限公司);50mlEP管(康宁生命科学有限公司);1000ml量筒;200ml量筒;100ml量筒;10ml量筒;研磨珠、1000ul移液枪(Eppendorf);200ul移液枪(Eppendorf)、100ul移液枪(Eppendorf);20ul移液...
凝胶具有网络结构,蛋白质物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大。此外由于SDS和巯基乙醇的作用,蛋白质成为带负电的线形分子,因此在SDS-PAGE凝胶电泳中,取决于蛋白质分子大小,这就大大提高了分辨能力。分子量大的蛋白涌动较慢,分子量小的蛋白质涌动较快。
[6].取15μl蛋白样品上样,12%SDS-PAGE电泳,电极缓冲液为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 [7].按次序上样,一定安排已知分子量的标准物。注意:如有空置的加样孔,须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液,以防相邻泳道样品的扩散。注意加样时间要尽量短,以免样品扩散,为避免边缘效应。 [8].电泳。开始时电压为8V/cm凝胶...
1.掌握SDS-PAGE电泳的操作步骤。 2.学会用电泳图分析原核表达效果 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基磺酸钠)后,蛋白质亚基...
2.Western blot（蛋白质印迹法）的实验原理 （1）当我们把混合样品通过SDS-PAGE电泳分离之后，理论上...
此项技术的原理,是根据检体中蛋白质分子量大小的不同,使其在电泳胶中分离。在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中,SDS-PAGE更是必不可少的操作,其通常用于检测蛋白的表达情况(表达量,表达分布),以及分析目的蛋白的纯度等。 SDS-PAGE作用机理 蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-),不同的蛋白在不同的pH值下表现出...