• 用水或异丙醇覆盖凝胶表面,以保持均匀的表面,室温下凝固约 20-30 分钟。二、 可能出现的问题及解决方案 在SDS-PAGE凝胶制备过程中,可能会遇到各种问题。以下是一些常见问题及其解决方案:1. 漏胶问题:• 原因:玻璃板未对齐或缺损,垫片密闭性不良。• 解决方案:确保玻璃板干燥,对齐后紧锁夹子,检查...
SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)是一种常用的蛋白质电泳技术,用于分离和定量蛋白质。以下是制作SDS-PAGE凝胶的基本配方和制胶步骤: 配方: 1. 1%丙烯酰胺(Acrylamide)溶液:将3.7g丙烯酰胺和60μl N,N'-亚甲基双丙烯酰胺溶解在0.5ml双蒸水中,搅拌均匀。 2. 2.5%BT(Bis-Tris...
SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,是一种间断的电泳系统,通常用于分离分子量在5—250kDa之间的蛋白质。十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate ,SDS)和聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel ,PAG)组合使用可以消除结构和电荷的影响,从而仅根据分子量的差异来分离蛋白质。SDS-PAGE的特性:在一定浓度时,...
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。因此凝胶由上层的浓缩胶和下层的分离胶组成。上下两层胶的的区别在于Tris-HCl 的 pH 值和丙烯酰胺的浓度不同。图2:聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分离示意图 上层的浓缩胶的pH为6.8,下层的分离胶的pH为8.8,上层为负极,下层为正极。
浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白...
- 用于形成凝胶中的聚集堆积层(stacking layer)。 -配方为: 30g Tris base (pH 6.8) 144g glycine 1gSDS 将固体溶解于1L蒸馏水中,并调整pH至6.8 四、样品处理缓冲液配方: 1. 样品加载缓冲液(sample loading buffer) -用于处理蛋白样品,以便在凝胶上获得良好的分离效果。 -配方为: 0.5M Tris-HCl(pH 6.8)...
PAGE 如果将蛋白质变性并置于电场中,它们将以相同的速度向正极移动,不会按大小分开。 所以我们需要将蛋白质放入一个允许不同大小的蛋白质以不同速率移动的环境中。 选择的环境是聚丙烯酰胺,它是丙烯酰胺单体的聚合物。 当这种聚合物形成时,它会变成凝胶,我们将用电将蛋白质拉过凝胶,因此整个过程称为聚丙烯酰胺...
在PAGE凝胶中引入SDS(十二烷基磺酸钠,含有大量带负电荷的SO32-),SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构,在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS,好比蛋白质穿上带负电的“外衣”,蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了,从而起到消除各蛋白质分子之间自由的电荷差异的作用,蛋白...
SDS-PAGE电泳是实验室比较常用的一个实验,关于SDS-PAGE电泳的一些代表性问题,现集中整理一下以供大家参考指正。 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶,是由丙烯酰胺单体(Acr)和少量的交联剂N,Nˊ-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂(过硫酸胺或核黄素)和加速剂(N, N,NˊNˊ-四甲基乙二胺)的作用下聚合交联成的三维网状...