曲线的斜率可用于测定反应效率,100%效率代表每个循环中的模板均实现了完美倍增,但大多数科学家认为反应效率应在90%至110%之间。 2、灵敏度和可重复性 效率在90–110%的理想窗口内的标准曲线确定了RT-qPCR反应可测量的起始模板量范围。某...
qPCR的数学原理如图7所示：图7.qPCR的数学原理和标准曲线图 从线性方程可以看出，lg(N初始模板量)与Ct值呈负线性关系，即模板拷贝数越多，其Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品绘制标准曲线，根据荧光基团发出的荧光强度与PCR 扩增产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行实时监测并得到未知样品的Ct值，即可通...
取1 μL cDNA为模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat#11195ES)扩增20个不同GC含量(25-65%)、不同表达丰度的基因。 线性检测范围广,Total RNA 10 pg-5 μg 图7. 以10 pg-5 μg的293T细胞的总RNA为模板,使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat#11141ES)合成cDNA。取1 μL cDNA为模板...
在进行RT qPCR实验时,要获得理想的扩增曲线,需从引物设计和异常结果分析两方面入手。首先,引物设计需跨越外显子连接,确保特异性,并通过BLAST检测验证。引物长度应适中,GC含量需平衡,且3′端避免选择A,以防假阳性。同时,引物应避免自身及相互间的互补序列,减少二级结构干扰。PCR产物长度也需控制在合适范围内。其次,...
RNA提取是RT-qPCR实验成功的首要步骤,RNA的质量直接关乎RT-qPCR实验的结果。但是在实验过程中我们经常会碰到RNA提取实验翻车的情况,主要是因为RNA的分子结构不稳定和无处不在的RNase对RNA的降解造成的。 由此可见,想要提取到高质量的RNA并非易事。今天,小翌主要从样本选择、样本采集与保存、RNA提取这三个方面来阐述...
RT qPCR实验怎么做出理想曲线 04月30日 常见问题解析: 1. 引物设计技巧 1)引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接,其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界。这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增到假阳性的风险。 2)引物应具有特异性。引物设计完成以后,应对其进行BLAST...
通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:如何评估RNA质量?》一文的学习。相信大家已经获得了优质的RNA,即将进入逆转录环节。 对于逆转录,大家都知道它是以RNA为模板,在逆转录酶的作用下,合成互补DNA (complementary DNA,cDNA)的过程(如图1)。但对于过程中起关键作用的逆转录酶,可能比较陌生。接下来,让小翌给...
通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:逆转录酶,你真的了解吗?》一文的学习,相信大家对逆转录酶有了一定的了解,但选对了逆转录酶并不意味着你的逆转录实验就大功告成,逆转录引物的正确选择也是重要一环。根据不同实验目的,逆转录引物的选择也是大相径庭。接下来,小翌与大家一同学习下逆转录引物的相关知...
实时荧光RT-PCR技术(RT-qPCR)利用荧光标记探针对扩增产物量进行实时跟踪,再根据扩增曲线计算出起始模板量,即样本病毒载量。下图是利用RT-qPCR进行新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)载量测定的主要过程。请据图回答: (1)过程①中,RNA提取裂解液可同时灭活病毒,原因是 。采集到的样本要迅速进行病毒灭活处理,其目的是 。RNA...
rt-qpcr实验，为什么我的溶解曲线前面会有一个凸起的小峰，这算杂峰吗？[图片] [图片] rt-qpcr实验...