RT-qPCR是一种对特定DNA进行定量分析的方法，其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行荧光定量PCR，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性...
PART 03 逆转录引物的选择 RNA类型: 1、真核生物mRNA 2、miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板 引物选择:Oligo(dT) 原因: 1、真核生物mRNA含有poly(A)尾,可以Oligo(dT)引物结合 2、miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾,故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合 ...
目前引物的设计主要借助一些分子生物学软件或在线工具来实现,常见的引物设计软件有Oligo 6、Primer Premier 5及Primer 3等。 2.RNA提取 RNA提取一般可以使用专业的商品化RNA提取试剂盒,按说明书操作即可,或者TRlzol试剂提取,具体步骤如下: (1) 样品准备:贴壁细胞:6孔板取1个孔的细胞加入1ml Trizol,室温裂解10 min...
找到菜单栏里的Analyze,Primer Search 或者直接鼠标右键单击Nucleotide sequence 也会跳出来Primer search 这个对话框。 好了,下面我们就可以来设置引物参数了! 点击Primer Parameters,设置引物的退火温度(当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。它足...
(1)设计具有高熔解温度(Tm)的引物; (2)进行BLAST搜索,确保引物不与数据库中的其他序列匹配; (3)避免包含重复序列、多聚G/C序列和3'末端的自由能高的序列。 2. 长度 RT-qPCR引物的长度应在18-24个核苷酸之间。引物过短可能不够特异,而过长可能无法有效地结合到目标序列上。
物种选择HUMAN,粘贴CDS,单击Pick Primers(获取引物) 3.参数设置 有特殊要求的参数可以下拉首页页面在此设置,可根据自己的设计需要对参数进行设置。 4、引物序列输出 在获取的结果中,有4对引物供选择。 四、GenScript在线设计RT-PCR引物--步骤简单,最实用(可选择跨内含子)!
RT-PCR引物的选择 逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。 RT-PCR引物设计原则 1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子...
PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，反应体系中加入 dNTP、Mg2+ 等原料，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程，可快速特异性地在体外扩增目的 DNA[1][2]。知识链接 Ct 值 (Cycle...
通常RT primer可分为三类:oligo dT,随机引物和基因特异性引物。根据不同的实验需求选择适合的引物进行使用。 1、如果模板为真核生物来源,且后期cDNA用于常规PCR扩增,建议选择Oligo(dT);若后续实验仅用于qPCR,建议将Oligo(dT)与随机引物混合后使用,可提高反转录效率。
(3) GC含量和Tm值,引物GC含量控制在40%~60%之间,Tm值应尽量在55~65℃之间,一般为60℃左右; (4) 引物3′端末端避免选择A; (5) 碱基分布:引物中四种碱基的分布是随机的,3′端避免超过3个连续的G或C; (6) 引物设计区域应避开复杂二级结构;