在生物科研里，RT-qPCR 至关重要。引物与探针则是关键，需从 NCBI、Ensembl 精准获取基因序列，依参数、用工具设计，再经验证优化，开启精准实验大门。获取目标序列 从NCBI、Ensembl 等数据库中获取目标基因的 cDNA 或 mRNA 序列。确保所获取的序列准确无误，并且是目标基因的全长序列或包含目的片段的区域。引物设计...
Oligo引物(dT)包含锚定位点,确保引物结合至mRNA 3'端poly(A)尾部。随机引物长度6-9个碱基,在RNA转录过程中,可退火至多个位点,提高cDNA产量。序列特异性引物是靶向特异的RNA序列的定制引物,可产出特异的cDNA库。通常情况下将Oligo引物与随机引物混合使用为逆转录酶提供结合位点。当检测RNA病毒时需要使用序列特异性引物...
RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物，引物设计的好坏，关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否，所以引物设计是实验成功的第一步。引物设计有以下几个原则：(1) 引物最好跨内含子设计（此原则下设计的引物将不受反转录试剂盒中是否含有gDNA Remover的影响）；(2) 引物长度一般在18~30 nt之间，扩增产物...
好了,下面我们就可以来设置引物参数了! 点击Primer Parameters,设置引物的退火温度(当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。它足够低可以保证引物同目的序列有效退火;但同时还要足够高,以减少非特异性结合。一般低于引物的Tm值5度左右) 小编我一般...
RNA的荧光定量PCR引物要求与普通qPCR相同,但要特别注意因为扩增的序列为RNA反转录后的cDNA,因此扩增的序列不能包含内含子,只能设计在外显子上,因为成熟mRNA的内含子是被剪切掉的。 四、ChIP-qPCR 染色质免疫沉淀(ChIP)是通过特异性抗体识别和结合目标蛋白,共沉淀出与其互作的DNA,从而检测目标蛋白互作的靶基因的技术...
定量(RT-qPCR)引物设计 软件:primer primer6.0 单个基因 批量设计 以批量设计为例 1、 放入基因文件 2、依次点击analyze—primer search 弹出以下界面 选择前500bp设计引物,长度>500bp的全部改为500bp,<500bp的不做改动 点击primer parameters 退火温度改为60,长度Length先默认,Amplicon Length80-120,点击search...
探针长度设计为 28bp,序列为 5' - FAM - CCACACAGCTGAGAGGGAAATCGCT - TAMRA - 3'。其中 FAM 为荧光报告基团,TAMRA 为淬灭基团。探针的 Tm 值为 68℃,高于引物 Tm 值,GC 含量为 57%,符合设计原则。检查发现探针与目标序列完全互补,不存在错配情况。 4.实验验证与调整 将合成的引物和探针用于 RT - ...
选中某一对引物,点击Enter to primer list,两次OK后,即可在Primer,Primer List,Active/loaded看到引物序列,注意:[S1]开头为上一步中选中的那对引物序列,并没有导入primer list,所以不能打开。 Fig7.PNG 选中某一条序列直接双击打开,看到该序列的详细信息。
1、针对特定序列设计的反转录引物 2、miRNA(茎环法)的反转录,需要根据基因序列设计对应的引物 【注】:为提高反转录效率,并保障获得更加完整的cDNA,建议将Oligo(dT)和随机引物混合使用。 PART 04 精品推荐 为方便大家对逆转录引物的选择,翌圣生物通过基因工程技术开发出Hifair®III系列逆转录试剂盒,包括两种引物形式...
首先，特异性是设计RT-qPCR引物的关键。引物应只扩增目标序列，避免与其它DNA或RNA序列产生交叉反应。确保特异性可通过以下方法实现：使用具有高熔解温度（Tm）的引物；进行BLAST搜索，确保引物不与数据库中的其他序列匹配；避免设计包含重复序列、多聚G/C序列以及3'末端自由能高的引物。引物的长度在18-24...