引物可分为三种引物Oligo引物(dT)、随机引物和序列特异性引物。Oligo引物(dT)包含锚定位点,确保引物结合至mRNA 3'端poly(A)尾部。随机引物长度6-9个碱基,在RNA转录过程中,可退火至多个位点,提高cDNA产量。序列特异性引物是靶向特异的RNA序列的定制引物,可产出特异的cDNA库。通常情况下将Oligo引物与随机引物混合使用...
探针的 Tm 值为 68℃,高于引物 Tm 值,GC 含量为 57%,符合设计原则。检查发现探针与目标序列完全互补,不存在错配情况。 4.实验验证与调整 将合成的引物和探针用于 RT - qPCR 实验,以人不同组织(如肝脏、肌肉、脑组织)的 cDNA 为模板。实验结果显示,β - actin 基因在不同组织中均能有效扩增,CT 值在...
RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物，引物设计的好坏，关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否，所以引物设计是实验成功的第一步。引物设计有以下几个原则：(1) 引物最好跨内含子设计（此原则下设计的引物将不受反转录试剂盒中是否含有gDNA Remover的影响）；(2) 引物长度一般在18~30 nt之间，扩增产物...
RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成(图1、表1)。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起,使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中,逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成,使用不同的优化...
在生物科研里，RT-qPCR 至关重要。引物与探针则是关键，需从 NCBI、Ensembl 精准获取基因序列，依参数、用工具设计，再经验证优化，开启精准实验大门。获取目标序列 从NCBI、Ensembl 等数据库中获取目标基因的 cDNA 或 mRNA 序列。确保所获取的序列准确无误，并且是目标基因的全长序列或包含目的片段的区域。引物设计...
RT-qPCR先通过反转录酶将RNA逆转录成cDNA,然后利用qPCR技术对cDNA进行定量分析。RT-qPCR技术广泛应用于RNA表达水平的研究,如基因表达分析、病毒载量检测等。 RNA的荧光定量PCR引物要求与普通qPCR相同,但要特别注意因为扩增的序列为RNA反转录后的cDNA,因此扩增的序列不能包含内含子,只能设计在外显子上,因为成熟mRNA的...
通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(三):逆转录酶,你真的了解吗?》一文的学习,相信大家对逆转录酶有了一定的了解,但选对了逆转录酶并不意味着你的逆转录实验就大功告成,逆转录引物的正确选择也是重要一环。根据不同实验目的,逆转录引物的选择也是大相径庭。接下来,小翌与大家一同学习下逆转录引物的相关...
RT-qPCR引物应跨内含子设计,这是由于RT-qPCR以cDNA为模板,扩增片段较小。若不跨内含子设计,则扩增片段可能在同一个外显子内。此时,无论是cDNA还是基因组DNA均能扩增同一片段,导致误差。若跨内含子,则只有cDNA能够扩增,这样就避免了基因组DNA的污染。
定量(RT-qPCR)引物设计 软件:primer primer6.0 单个基因 批量设计 以批量设计为例 1、 放入基因文件 2、依次点击analyze—primer search 弹出以下界面 选择前500bp设计引物,长度>500bp的全部改为500bp,<500bp的不做改动 点击primer parameters 退火温度改为60,长度Length先默认,Amplicon Length80-120,点击search...
3. qPCR阶段 1)染料法:加入一对引物和SYBR GreenⅠ荧光染料。退火阶段,引物特异性结合在两条链上,为DNA聚合酶提供结合位点。SYBR GreenⅠ荧光染料是一种DNA双链小沟结合染料,DNA聚合酶延伸引物,形成双链,染料结合于双链小沟中发出荧光。反应体系内双链DNA浓度越高荧光信号越强。由于染料法无法在同一个反应中检测...