RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物，引物设计的好坏，关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否，所以引物设计是实验成功的第一步。引物设计有以下几个原则：(1) 引物最好跨内含子设计（此原则下设计的引物将不受反转录试剂盒中是否含有gDNA Remover的影响）；(2) 引物长度一般在18~30 nt之间，扩增产物...
1、针对特定序列设计的反转录引物 2、miRNA(茎环法)的反转录,需要根据基因序列设计对应的引物 【注】:为提高反转录效率,并保障获得更加完整的cDNA,建议将Oligo(dT)和随机引物混合使用。 PART 04 精品推荐 为方便大家对逆转录引物的选择,翌圣生物通过基因工程技术开发出Hifair®III系列逆转录试剂盒,包括两种引物形式...
RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物,引物设计的好坏,关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否,所以引物设计是实验成功的第一步。引物设计有以下几个原则: (1) 引物最好跨内含子设计(此原则下设计的引物将不受反转录试剂盒中是否含有gDNA Remover的影响); (2) 引物长度一般在18~30 nt之间,扩增产物长度...
RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物,引物设计的好坏,关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否,所以引物设计是实验成功的第一步。引物设计有以下几个原则: (1) 引物最好跨内含子设计(此原则下设计的引物将不受反转录试剂盒中是否含有gDNA Remover的影响); (2) 引物长度一般在18~30 nt之间,扩增产物长度...
相信科研小伙伴们都已经用过Pubmed来设计引物了,基本就是 “傻瓜式操作”就解决了!但这里还需提醒小伙伴们两点: 1. 需跨越至少一个外显子连接(一般我们用来做RT的RNA都是通过Trizol抽提法分离出来的,为了避免基因组的DNA也有可能被扩增出来,就要至少跨越...
RT-PCR引物的选择 逆转录引物一般包含3种:oligo dT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。 RT-PCR引物设计原则 1. 上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200 bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子...
通常RT primer可分为三类:oligo dT,随机引物和基因特异性引物。根据不同的实验需求选择适合的引物进行使用。 1、如果模板为真核生物来源,且后期cDNA用于常规PCR扩增,建议选择Oligo(dT);若后续实验仅用于qPCR,建议将Oligo(dT)与随机引物混合后使用,可提高反转录效率。
4)Tm值:一般正常qPCR产物,大小在100-300bp之间,熔解曲线Tm大多在80℃以上,若Tm<80℃,有可能出现引物二聚体。 如若反复排除仍无法找到原因,建议将qPCR的产物作一次琼脂糖凝胶电泳,看是否在相应扩增条带上有显影(图 2.4,来源:QPCR-如何判断引物设计是否有问题)。
1)染料法:加入一对引物和SYBR GreenⅠ荧光染料。退火阶段,引物特异性结合在两条链上,为DNA聚合酶提供结合位点。SYBR GreenⅠ荧光染料是一种DNA双链小沟结合染料,DNA聚合酶延伸引物,形成双链,染料结合于双链小沟中发出荧光。反应体系内双链DNA浓度越高荧光信号越强。由于染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段,...
相信科研小伙伴们都已经用过Pubmed来设计引物了,基本就是 “傻瓜式操作”就解决了!但这里还需提醒小伙伴们两点: 1. 需跨越至少一个外显子连接(一般我们用来做RT的RNA都是通过Trizol抽提法分离出来的,为了避免基因组的DNA也有可能被扩增出来,就要至少跨越至少一个exon-exon junction了)。