RT-PCR反应合成cDNA引物的选择指引 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。合成cDNA引物的选择是分子...
一般合成cDNA使用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)。逆转录酶PCR (RT-PCR)是扩增靶RNA的聚合酶链反应的一种变体。在PCR之前添加逆转录酶(RT)酶使扩增和检测RNA靶标成为可能。逆转录酶转录模板RNA并形成互补DNA (cDNA)。单链cDNA通过DNA聚合酶转化为双链DNA。这些DNA分子...
cDNA合成及RT-PCR cDNA的合成RealTimePCR 目录 1实验原理2实验步骤3结果分析 1实验原理 基因表达：基因组DNA 信使RNA（mRNA)蛋白质 蛋白质执行生命活动 反转录：以RNA为模板，通过反转录酶，合成DNA的过程。我们通过反转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR)的方法检测目的基因在特定组织和细胞中，mRNA水平的表达丰度。...
RT-PCR已被广泛应用于多种分子生物学应用中,包括基因表达分析、基因测试、RNA干扰验证检测、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。 RT-PCR的方法之一步法和两步法 RT-PCR其操作方法分为两种,即一步法和两步法。一步法RT-PCR,逆转录同PCR扩增结合在一起,即cDNA合成与...
首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 用于反转录...
包含两个独立反应,先进行第一链cDNA合成,然后再通过PCR扩增第一步骤中所得cDNA。 1、优点 1)RT过程 ①使用Oligo dT和Random Primer最适比例混合液作为引物,对RNA模板的要求宽泛,如大多数RT Enzymes对1ng-1μg起始模板量总RNA都可高效率逆转录。 ②两步RT-PCR可将大批量的RNA转化为cDNA,然后储存cDNA用于后续实...
(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)可以:(1)分析基因的转录产物;(2)获取目的基因;(3)合成cDNA探针;(4)构建RNA高效转录系统。 实验方法原理 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT...
在进行RT-PCR合成cDNA的过程中，引物的选择至关重要。首先，对于难以完全拷贝的特定mRNA，可以使用随机六聚体引物。这种非特异性引物让体系中的所有RNA分子都参与cDNA的第一链合成，PCR扩增过程中会赋予所需的特异性。然而，值得注意的是，通常采用随机六聚体合成的cDNA中，约有96%来自rRNA。相比之下，...
1从供体生物特定分化型组织或细胞中提取纯化总RNA,其中目的mRNA为高丰度mRNA;2以Oligo(dT)为引物,以总RNA中的总mRNA为模板,在反转录酶作用下合成互补的总cDNA;3变性:升温至94~95°C加热5min,使总mRNA : cDNA的杂交链由于热变性而分开成单链;4退火:降温至40~60°C,加入“上游”寡核苷酸引物和“下游”寡核苷...
cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR具有其它优点(表4.2),cDNA合成和扩增反应在同一管中进行,不需要打开管盖和转移,有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度,最低可以达到0.1pg总RNA,因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR,一般使用基因特异性引物(...