RT-qPCR先通过反转录酶将RNA逆转录成cDNA,然后利用qPCR技术对cDNA进行定量分析。RT-qPCR技术广泛应用于RNA表达水平的研究,如基因表达分析、病毒载量检测等。 RNA的荧光定量PCR引物要求与普通qPCR相同,但要特别注意因为扩增的序列为RNA反转录后的cDNA,因此扩增的序列不能包含内含子,只能设计在外显子上,因为成熟mRNA的...
在进行RT-PCR实验之前,你需要准备以下试剂:0.1% DEPC 溶液、Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC 水配制的75%乙醇、无 RNase-free 的纯水、反转录试剂盒、dNTP mix、Taq 酶、buffer 和凝胶电泳缓冲液等。🧬 仪器和耗材 你需要以下仪器和耗材:Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪、Thermo Scientific Arktik PCR 仪...
1)模板量低或基因表达丰度低,建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。 2)qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低,建议通过标准曲线确认扩增效率。 3)扩增产物过长,建议用三步法程序扩增或优化引物,扩增产物长度最好不...
根据样品浓度计算逆转录所需RNA量(根据实验经验,RNA总量为0.85µg时 结果最佳。因此,由样品浓度(µg/µl)×逆转录所需RNA量(µl)=0.85µg 四、RT-PCR 4.1RT过程: 试剂准备(TaKaRa): 1.dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP(10mMeach) 2.Random 6 mers(20um) 3. RNA模板 4. DEPC处理无菌水 ...
2. 反转录 PCR (rtPCR) rtPCR:检测RNA。 01 反转录 反转录实验原理: 根据不同的情况选择不同的反转录引物: (1)RNA 有 polyA 尾:用Oligo(dT)要求作为反引物,要求RNA 质量好,否则poly(A) 尾可能降解,造成全长 cDNA 合成量大大降低。 (2)RNA 没有 polyA 尾:如原核生物 RNA、真核生物的 rRNA、tRNA...
先电泳看看带的大小对不对，如果目的带清晰，而且没有太多的其他杂带，则可以进一步测序，如果实验室有条件的，可以在测序前，把PCR产物连接到T载体上，然后T载体去测序，测序后进行比对，看看跟扩增的是不是目的基因，如果是，从测序可以看出没有出现漏碱基或是移码之类的。如果电泳结果出现很多杂带（...
RT-PCR引物设计的方法步骤如下: 1、在 NCBI 上搜索到该基因,找到该基因的 mRNA ,在 CDS 选项中,找到编码区所在位置,在下面的origin 中, Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、打开 Primer Premier5 ,点击 File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口, Copy 目的序列在输入框内(选择 As),此窗口内...
一文掌握RT-PCR..1)反应体系污染,结合NTC和NRC结果确认污染情况,建议从水,引物,酶和环境等逐一排除污染。 2)试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效,建议用新的试剂做对比实验。
解析 设计引物的时候,选择扩增跨内含子的片段来设计引物.或者提取RNA的时候用专门的RNA提取试剂盒.或者提取RNA后加入一定DNA酶,消化一段时间再纯化,反转录.结果一 题目 利用RTPCR获得目的基因时,如何鉴定其中有无DNA污染?设计一套实验排除DNA造成的污染 答案 设计引物的时候,选择扩增跨内含子的片段来设计引物. ...
荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程。随着 PCR 反应的进行,反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,结合相应的软件对产物进行分析,可以得到荧光扩增曲线,计算待测样品初始...