如果逆转录前没有确认模板中是否含有gDNA,可以在qPCR实验中设立NRC阴性对照组(以未逆转录的RNA作为模板)验证,如下图所示,NRC具有明显的扩增,表明RNA中可能含有gDNA污染。 图3. qPCR扩增曲线图。NRC:阴性对照组 了解了如何识别gDNA污染,那么如何去除呢?通常可以在RNA提取时或逆转录前用DNA酶或gDNA清除剂去除gDNA。...
qPCR实质上是一种PCR扩增反应，但它与普通PCR有所不同。普通PCR是将的得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过核酸染料染色并借助紫外凝胶成像仪进行观察，最后通过终产物进行定性或者半定量分析；qPCR是在反应体系中引入荧光基团（染料或者探针），进而对qPCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应的过程，结合相应的qPCR仪自...
RT-QPCR 基本原理和概念 实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过在PCR反应体系中加入荧光染料(SYBR Green)或荧光标记的特异性的探针,与DNA产物特异性结合,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可...
熔解曲线一般用于染料法,出现单峰说明扩增产物特异性好;出现杂峰特异性差,存在非特异性扩增。若熔解曲线只有单峰且对应温度是退火温度则是靶标发出的荧光,实验结果有效。 图3. 染料法熔解曲线 2)扩增曲线:将已知浓度的靶标稀释几个数量级后进行qPCR反应循环扩增,并用产生的荧光信号与相应浓度生成标准曲线。将未知样本...
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的，其荧光标记方法分为两种：荧光染料嵌合法和荧光探针法。1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料，该染料在游离状态下几乎不会产生荧光，可以非特异地结合在双链DNA的...
Ct 值 (Cycle threshold，循环阈值)，是指 qPCR 反应中荧光信号达到设定阈值时对应的循环数 (一般 Ct 值在 20-30 之间)。扩增曲线 (Amplification curve) 是指随 PCR 反应进行，根据荧光信号强度随着循环数变化而绘制的曲线。正常的扩增曲线 (S 型) 包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。熔...
实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中,反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征,而非在一定循环数后...
1、引物扩增效率低 一般通过做标准曲线评估引物的扩增效率,做标准曲线的具体操作具体方法如下: ① 模板稀释 将反转录的 cDNA 如图所示进行 10 倍梯度稀释,6 个梯度,依次设置为 S1-S6。 图2. cDNA 稀释流程 ② 根据 qPCR 试剂配制 qPCR 体系。 ③ 样品设置...
反应结束后确认RT-qPCR 的扩增曲线和融解曲线,进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。 5.数据分析 一般有相对定量和绝对定量两种分析方法,相对定量是检测实验组和对照组中靶基因的倍数差异,特别适合在对RNA模板的数量不能精确定量,或者只需要知道目的基因的表达差异时,另外,相对定量需要进行归一化...
在RT-qPCR中,对扩增过程进行实时监测,根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。 图2:图片来源于网络,若有侵权联系删除 整条曲线可以分为3个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量...