异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。 1.Ct值偏大(如Ct值>30) 1)模板量低或基因表达丰度低,建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。 2)qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低,建议通过标...
qPCR 反应体系配制完成后,可参照下表进行样品设置,每个样品均设置 3 个技术性重复。 ④ qPCR 反应结束后,以模板系列稀释倍数 log 值为 X 轴,以对应的 Ct 值为 Y 轴(反之亦可),制作标准曲线,如下图。 图3.标准曲线 当扩增效率 E 应在 90～110% 之间...
而进行除此之外的RT-qPCR实验，都可以使用荧光染料法。表1.DNA结合染料法和TaqMan探针法对比 二、实验步骤 图5.RT-qPCR实验步骤示意图，图片来源：bing.com 1.设计引物 RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物，引物设计的好坏，关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否，所以引物设计是实验成功的第一步。引...
模板数量也是一个重要的考虑因素。PCR中模板太多或太少都会导致反应失败和qPCR扩增曲线看起来异常。图11.3A显示了含有10倍连续稀释的人工合成寡核苷酸模板的反应。较下部的稀释物太浓,不足以使反应有效或让仪器有效处理基线数据(图11.3B),导致扩增曲线异常和数据不可靠。
因此,当拷贝数太低时,很难给每个反应中加入等量的模板,这也就造成了扩增产量的不一致,从而影响实验的重复性。 针对重复性差的问题大致就是这样几方面因素导致的,那么在RT-qPCR系列软文的最终期,我们将对扩增曲线不一致的问题做详细解析,敬请伙伴们继续关注荧光定量之常见问题处理篇(下)。
以人MCF7细胞提取的总RNA(1.28pg-20ng)为模板,应用5×One-step Probe RT-PCR Mix直接进行qPCR,1-8RNA模板分别为:20ng、4ng、0.8ng、0.16ng、0.032ng、6.4pg、1.28pg和H2O。图A:扩增曲线。图B:标准曲线。使用方法:1.进行RNA的One-Step qPCR检测进行RNA的qPCR检测时,检测模板为RNA,在反转录酶的作用下,由...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
首先看扩增曲线,如果引物能扩增目的片段,扩增曲线呈S型。如果呈指数增长型,可能是cDNA浓度过低,可适当增加cDNA浓度。再看溶解曲线,溶解曲线应该只有一个峰值,而且峰值的位置是在Tm附近,距离Tm较远,或存在多个峰值则需要重新设计引物。最后,如果怀疑仪器传感器问题,可以将QPCR产物做琼脂电泳,如果引物能扩增片段,会在80-...
2-ΔΔCt法是 Pfaffl 法的简单特例。 Real-time qPCR 数据分析——(2)绝对定量 mRNA 拷贝数 待测基因分子量= 碱基数×324 样本拷贝数(copies/ul)= 质粒浓度/待测基因分子量×6×1014 6、扩增效率低 8、扩增曲线的异常?比如“S”型曲线?