2. 严格按照试剂盒说明进行操作,避免使用涡旋振荡。 3. 确保 PCR 仪器的正确设置,以获得准确的扩增结果。 4. 试剂需在规定条件下储存和使用,如 SYBR Green I Master 需避光放置。 5. 注意数据分析方法的选择,如标准曲线法、绝对定量法等。 Q2000B荧光定量PCR 仪能够提供高灵敏度和高准确度的 RT-QPCR 实验结果。
而进行除此之外的RT-qPCR实验，都可以使用荧光染料法。表1.DNA结合染料法和TaqMan探针法对比 二、实验步骤 图5.RT-qPCR实验步骤示意图，图片来源：bing.com 1.设计引物 RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物，引物设计的好坏，关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否，所以引物设计是实验成功的第一步。引...
📏 RNA浓度测定:使用如Nano drop等仪器测定RNA浓度。 🔄 反转录合成cDNA:使用反转录酶将RNA转换为cDNA,作为qPCR的模板。 🧪 qPCR反应体系配置:实验通常使用2×浓缩的real-time qPCR MasterMix。需要加入模板和引物。每个样品至少做3个平行孔,以确保数据的可统计性。 💻 上机操作:将配置好的反应液放入实时qP...
RT-qPCR 通常用于基因表达分析、病毒载量定量和基因突变检测等应用。 RT-qPCR原理的三个主要步骤: 1 反转录: 使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。 该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。 反转录过程中使用特定引物。 2 PCR扩增: 使用特定引物对cDNA进行PCR扩增,这些引物环绕目标区域。 PCR...
使用Gene Specific Primer 时,建议反转录反应条件设置为 42℃ 15 min。PCR 反应有非特异性扩增时,将温度升到 50℃会有所改善。 合成的 cDNA 需要长期保存时,请于-20℃或更低温度保存。 在反转录反应中,TB Green qPCR 法的 RT Primer Mix 用量为 1 μl, 探针 qPCR分析法的用量为 4 μl。
2)简化版方式:根据板间校正的原理,主要控制的是各板之间的内参基因,因此:如果使用的qPCR体系完全一致(包括样本、酶、qPCR板子/膜、仪器等),重复实验相隔时间很近,内参基因在两次实验之间CT值相差很小(0.5以内),整体重复量并不是特别大(如96×3<384)则可能可以考虑,在各板各自计算相对表达量之后,将2^{-\Delta...
来自德国MB公司的RNA病毒检测试剂盒(RT-qPCR法)(英文名:ConviFlex™RT-Taq mix)用于定性检测和分析RNA病毒和RNA分子,特别适合检测新冠病毒等此类病毒。缔一生物作为MB公司国内总代理,为大家介绍RNA病毒检测(RT-qPCR法)试剂的操作步骤。 步骤1. 冻干粉ConviFlex™RT-Taq Mix,离心5秒钟,然后加入260μl复溶...
最初,使用嵌入式染料进行实时荧光PCR (qPCR) 产物定量。但这些染料存在重大缺点,即会同时检测特异性以及非特异性PCR产物的扩增量。 TaqMan方法的开发 通过引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针,实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用,使得实时定量的方法得到了发展,实现了仅对...
4×TaqPath™ 1-Step RT- qPCR Master Mix 12.5 µL1× TaqMan® Gene Expression Assay 2.5 µL 如果使用的不是TaqMan® Gene Expression Assay，建议使用引物终浓度400-900 nM，探针终 浓度100-250 nM。样品*根据需要调整 1 pg至100 ng RT-PCR Grade Water根据需要调整 —总体积50 µL ...