缺点:可能产生假阳性结果,需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性;需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增;不适合进行多重qPCR检测。 ■而还有一种是使用荧光探针,又叫TaqMan探针法,其原理是根据目的基因设计一个能与之特异性结合的荧光探针,该探针包含两个基团:一个荧光基团和一个淬灭基团,正常情况下因为淬灭基团...
缺点：可能产生假阳性结果，需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性；需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增；不适合进行多重qPCR检测。② 荧光探针法（TaqMan技术）：TaqMan探针是最早用于定量的方法，也是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核...
荧光探针法的优点:具有强大的特异性检测能力;高灵敏度;非常适合于进行多重qPCR检测;在PCR之后无需进行任何处理,从而节省时间和原料成本。 荧光探针法的缺点:需要根据不同的序列,合成不同的探针;探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性,定量时容易受试剂和酶性能的影响;淬灭难以彻底,本底较高;检测结果很难判断实际的扩增特性。
缺点: 1、特异性不是很高。染料可以插入任何双链DNA,包括引物二聚物和非特异性产物。 2、如果引物二聚体存在或者产物受到污染,得到的结果会不可靠。3、更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。 需要更多的时间进行结果分析。 二、寡核苷酸探针(Taqman) 这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短DNA分子),探针通常在5...
3. 适用于高通量扩增/筛选，快速且可重现性高。缺点：1. 无法分别对两步反应进行优化;2. 一步法无法保存反转录后的 cDNA 产物，无法分别对两步反应进行条件优化，因此灵敏性不如两步法;3. 单一样品检测的靶点数较少;4. 上下游基因特异性引物在42℃-50℃下更易发生二聚体聚合，从而导致非特异扩增。
考虑到RT和qPCR均是酶促反应,核心酶是Reverse Transcriptase和DNA Polymerase。而两个酶促反应在同一体系下进行,必然会牺牲其中之一的性能,因此该方法存在以下缺点:1、RT过程:①对模板RNA质量要求高:RNA质量的优劣严重影响逆转录效率;②模板使用量较大:一步法qRT-PCR使用基因特异性引物,而两步法qRT-PCR的RT过程使用...
两步法 RT-PCR有哪些优缺点？在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。首先用逆转录酶合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 qPCR 扩增，即 RNA 反转录与 qPCR 扩增分两步进行。使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。想了解...
最初,使用嵌入式染料进行实时荧光PCR (qPCR) 产物定量。但这些染料存在重大缺点,即会同时检测特异性以及非特异性PCR产物的扩增量。 TaqMan方法的开发 通过引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针,实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用,使得实时定量的方法得到了发展,实现了仅对特定扩增产物的...
三、优缺点 实时荧光定量PCR具有许多优点。首先,它具有高灵敏度,可以检测低拷贝数的基因表达。其次,由于采用了荧光标记技术,该方法具有高特异性,能够有效避免假阳性和假阴性结果的出现。此外,rtqPCR还具有高精度和高重复性的特点,能够提供准确可靠的实验数据。然而,实时荧光定量PCR也存在一些缺点。首先,该方法的成本较...