缺点:可能产生假阳性结果,需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性;需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增;不适合进行多重qPCR检测。 ■而还有一种是使用荧光探针,又叫TaqMan探针法,其原理是根据目的基因设计一个能与之特异性结合的荧光探针,该探针包含两个基团:一个荧光基团和一个淬灭基团,正常情况下因为淬灭基团...
相比于RT-PCR只能进行定性分析,RT-qPCR的优势在于能够进行定量分析。类似于RT-PCR,RT-qPCR定量分析RNA的方法有两种:一步法和两步法。这两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA,然后再将其作为qPCR扩增的模板,一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行,例如Magigen OneStep RT-qPCR Kit,减少了实验污染,提高了效率;而两步法...
5. 实时荧光定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆转录）的意思，所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR...
优点：1. 由于两步反应都在一个管中完成，因此该方法具有更少的实验误差;2. 一步法操作简便，加样环节少，更少的移液步骤能够减少污染的风险;3. 适用于高通量扩增/筛选，快速且可重现性高。缺点：1. 无法分别对两步反应进行优化;2. 一步法无法保存反转录后的 cDNA 产物，无法分别对两步反应进行条件优化，...
两步法 RT-PCR有哪些优缺点？在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。首先用逆转录酶合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 qPCR 扩增，即 RNA 反转录与 qPCR 扩增分两步进行。使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。想了解...
表1.一步法及两步法RT-qPCR优缺点比较 RT-qPCR逆转录过程 总RNA与mRNA的选择 在设计RT-qPCR实验过程中,决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度,但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。...
RT-qPCR反应时,寡核苷酸两个基团分离,即可检测到荧光信号,并与PCR产物同步。 使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游 互补序列的结合。 优点: 1、更有可能只放大所需的产物,由于引物和探针的结合具有特异性。 2、不需要解离曲线,只有探针与正确的目的序列结合时才能检测...
图1.一步法与两步法RT-qPCR 一步法 优点: 1. 由于两步反应都在一个管中完成,因此该方法具有更少的实验误差; 2. 更少的移液步骤能够减少污染的风险; 3. 适用于高通量扩增/筛选,快速且可重现性高。 缺点: 1. 无法分别对两步反应进行优化; 2. 由于反应...