实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中,反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征...
直到1996年,Real Time Quantitative PCR的发表标志着qPCR的诞生。它引入了荧光标记的水解探针,并在每个PCR循环的延伸结束后采集荧光信号,将到达指数扩增期所需的循环数(Ct值,后经标准化统一为Cq值)与模板的初始浓度建立了关系。 在分子领域快...
1. 打开Q2000B荧光定量PCR 仪,确认仪器设置正确。 2. 在全真彩触控屏上编辑 RT-QPCR 实验程序,包括预变性、扩增循环、延伸等步骤。 3. 配置 PCR 反应体系,加入 cDNA 产物、Master Mix、引物等。 4. 将反应体系分装至多孔板中,设置阴性对照、空白对照、标准品和未知样品等。 5. 将多孔板放入 Q2000B 荧光定...
二、仪器上qPCR反应步骤的设置(图 2.1) 图2.1 qPCR反应体系设置 1、预变性 预变性是将样本和反应缓冲液混合在一起,在高温下(通常为95℃)孵育一段时间,以使DNA或RNA解离。这样做可以防止样本中的DNA或RNA在PCR反应中不完全解离,从而影响PCR反应的准确性。
1 qPCR仪器工作原理 qPCR仪器是由荧光定量系统和计算机组成，主要包括这三个反应模块：激发光发射源，接收装置，PCR反应模板。在PCR反应模块中进行qPCR反应，当仪器的激发光发射源发出一定波长的光线，遇到qPCR反应体系中的荧光基团则会反射另外一个波长的光线，此时被接收装置实时接收，接收的数据传送至计算机，计算机...
一步法RT-qPCR是常用的RNA分析方法之一。在一步RT-qPCR中,反转录酶和DNA聚合酶预混于同一管内,从而使得在单个反应中就可同时进行反转录和DNA扩增。相比于进行完反转录,准备试剂配制进行DNA扩增的两步法而言,一步RT-qPCR更加简单快速,移液步骤更少,污染...
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的，其荧光标记方法分为两种：荧光染料嵌合法和荧光探针法。1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料，该染料在游离状态下几乎不会产生荧光，可以非特异地结合在双链DNA的...
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光标记方法分为两种:荧光染料嵌合法和荧光探针法。 1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料,该染料在游离状态下几乎不会产生荧光,可以非特异地结合在双链DNA的...